内生菌Sphingomonas sp. HJY定殖水稻对毒死蜱胁迫的响应规律及其机理

Using the interaction of endophytes and plants to enhance the degradation of pesticide residues becomes a research hotspot lately. An endophytic bacterium named Sphingomonas sp. HJY was isolated from Chinese chives from our previous study. The bacterium has the ability to degrade chlorpyrifos in vitro. After being inoculated into its host, Sphingomonas sp. HJY could also accelerate the degradation of chlorpyrifos inside the host through endophyte-plants interaction, however, this only happened at the low level of the two treatments. On the basis of our previous study, this project intends to first study the degradation pathway of chlorpyrifos using LC-QTOF-MS and GC-MS-MS, and then find out the major degradation gene through whole genome, transcriptome sequencing and gene knockout technology. Meanwhile, the population of the inoculated HJY, the expression of the degradation gene and the dynamic of chlorpyrifos metabolites will also be investigated by plate counting method, RT-PCR and LC-MS/MS. Further, transcriptome and proteome analysis will be adopted to study the response mechanism of Sphingomonas sp. HJY-rice system under the stress of chlorpyrifos. The results will provide data support for the use of plant-endophyte interaction to enhance the degradation of pesticide residues, and new perspective for the control of pesticide residues pollution.

农药的作物吸收与代谢研究对于指导其安全合理使用具有重要意义，内生菌对植物体内农药等污染物的代谢调控作用近年来成为研究热点。我们前期针对我国使用广泛的农药毒死蜱，筛选获得一株植物内生菌Sphingomonas sp. HJY，对低浓度毒死蜱明显加速降解，而高浓度下则效果不明显。在此基础上，本项目拟首先利用LC-QTOF-MS及GC-MS-MS分析该菌株代谢毒死蜱的路径，结合全基因组测序、转录组分析及基因敲除验证等手段分析降解主效基因；进而通过平板计数、荧光定量PCR及LC-MS/MS分析，研究在不同剂量毒死蜱胁迫下，定殖于不同品种水稻中内生菌菌量、降解基因表达及毒死蜱母体和代谢物的动态规律，结合转录组和蛋白质组分析差异表达基因和蛋白，揭示内生菌增强代谢活性对水稻植株中毒死蜱残留量的响应规律及其分子机制。研究结果将为植物-内生菌互作增强农药代谢研究提供理论支撑，为农药残留汚染控制提供新的思路。

内生菌在调控植物体内污染物代谢及缓解污染物胁迫发挥了重要的作用，Sphingomonas sp. HJY是本团队前期筛选发现的一株降解毒死蜱活性的植物内生菌，在前期基础上本项目重点围绕HJY降解毒死蜱代谢路径的分子机制解析、HJY定殖对水稻植株中毒死蜱消解规律影响、HJY对不同浓度毒死蜱胁迫的响应规律以及HJY与水稻植株协同调控对毒死蜱胁迫的响应应答等方面开展研究。LC-QTOF- MS代谢物分析及转录组基因测序分析结果表明，3,5,6-三氯-2-羟基吡啶是Sphingomonas sp. HJY降解毒死蜱的主要代谢产物， HJY定植水稻降解农药可能是通过提高氧化胁迫耐受性，同时通过趋化绑定宿主植物并分泌胞外信号物质刺激植物共同代谢残留毒死蜱，接种HJY能有效降低毒死蜱胁迫下水稻体内超氧阴离子浓度、过氧化氢含量和丙二醛累积水平，并显著提高植株的株高、湿重及叶绿素合成量，这表明HJY定殖能提高水稻清除活性氧攻击的能力，缓解毒死蜱对植株胁迫压力；接种试验表明，毒死蜱在水稻各部位的残留含量与其内生菌定殖菌落数（CFU/g）显著负相关性，HJY在水稻根部定殖后开始逐渐向茎叶部转移，毒死蜱在接菌水稻各组织部位的降解速率大于非接菌水稻，至第4 d降解到未检出水平，HJY-rfp在毒死蜱处理水稻组织内的定殖含量从第4 d开始减少，表明水稻体内HJY的定殖迁移可能与植株毒死蜱残留降解有关；酶学研究及关联分析结果显示内生菌定殖能显著提高水稻PAL、APX、CAT、POD、SOD、GST、GR等抗氧化酶系活性，而这些酶系基因的表达水平与水稻残留毒死蜱的代谢速率存在正相关性；进一步研究发现，毒死蜱胁迫能改变水稻根系分泌物组分，其中氨基酸及有机酸成分的改变能影响内生菌HJY的趋化性。本研究初步阐明了内生菌Sphingomonas sp. HJY定植水稻对毒死蜱胁迫的植物应答及根系分泌物响应规律，为进一步深入开展毒死蜱胁迫诱导内生菌定植机理研究奠定了基础。