我国野生百合种质资源RGA分析及抗灰霉病候选基因的研究

百合是我国重要的商品花卉，在切花和种球生产中，灰霉病造成的危害日益严重。我国拥有丰富的百合种质资源，是抗病育种的重要亲本。在百合种质资源收集、繁殖的基础上，建立缓慢生长保存体系。在离体和活体接种条件下，鉴定百合资源的抗性，筛选出抗病性强的材料。根据已有抗病基因的保守结构域，设计引物，扩增抗病基因同源序列（RGA），对特异条带进行克隆、测序，并与GeneBank中的资料进行多重比较，构建分子系统进化树；依据所筛选出的序列设计特异引物，通过RT-PCR法，定量研究抗病候选基因在百合各组织器官中的表达模式以及受生物诱导胁迫后的表达响应，为百合灰霉病抗病基因的确定提供基础。 该研究对系统评价百合种质资源抗灰霉病的特性及抗病基因的克隆具有重要的理论意义，并对百合的抗病育种具有指导作用。

百合是重要的商品花卉，在切花和种球生产中，灰霉病造成的危害日益严重。我国拥有丰富的百合资源，是抗病育种的重要亲本。连续3年对我国百合主要分布区进行资源调查和收集，共收集野生百合30个种或变种，77份资源。在此基础上，通过形态、花粉、分子生物学方面对百合进行了系统分类和全面的评价，构建了目前最大的百合进化树，筛选出利用价值高的资源。在资源收集的基础上，建立16种野生百合的组培再生体系，在此基础上，研了百合的组培缓慢生长保存体系，通过低温（0-2℃条件下）、培养基中添加9%的蔗糖浓度和3.0 mg.L-1浓度的 ABA，同时减少基本培养基浓度（1/4MS），可以保存种质资源2年。该研究对于野生资源的保存、评价和利用具有重要作用。.对野生百合资源的灰霉病抗性进行了评价，筛选出岷江百合、泸定百合等高抗种，以及大花卷丹易感种。根据目前已发表的有关RGA的研究结果和岷江百合接种灰霉病菌后的转录组测序结果，筛选出特异引物。对RGA-PCR扩增得到500bp左右的目的条带，经回收、连接和转化，共选取1000个克隆进行测序。测序结果显示，百合RGA基本同时都具有NBS类抗病基因的4个保守基序：P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a和跨膜结构域GNPL，并且Kinase-2a的共有序列为LLVLDDMW，最后一个氨基酸为天冬氨酸（W），说明所分离的野生百合NBS-LRR类似物均属于non-TIR-NBS类型。对克隆的RGA在NCBI上BLAST和与已知抗病基因及其它已登录的植物RGA序列比对分析，并构建了系统发育树：百合的RGA聚为两个进化枝，可以分为5个组，其中RGA V与其它四个组的进化关系相对较远，为81%；百合RGA序列与其它单子叶植物RGA序列的进化关系相对较远，所选取的已知单子叶植物RGA序列单独聚为一组，只有RGA V与双子叶植物番茄抗枯萎病基因I2C聚为一组；这是百合RGA比较特别的地方。筛选差异较大的候选基因进行表达分析，初步筛选出P25-1、1L-2和1L-3与抗病性相关。另外首次从岷江百合中克隆了针对腐生营养型病菌抗性的关键基因LrCOI1，该基因全长1672bp，共编码557氨基酸，并对接种病菌后该基因的表达进行了分析。同时建立了百合可视化和删除标记的转基因体系，为所克隆基因的功能验证和抗病转基因植株的获得提供基础。