整合素连接激酶调控Cx43在改善缺血再灌注心律失常的机制研究

Ischemia-reperfusion（I/R） arrhythmia is a common phenomenon of myocardial infarction, with great harms, but its mechanism is not yet clear. Our previous study found that ILK activation can prevent ischemia-reperfusion arrhythmia, and inhibite the remodeling of myocardial connexin 43, however, the mechanism is indeterminate. Redistribution of Cx43 is the basis of reperfusion arrhythmia, and Akt, as a key kinase in RISK RISK pathway, is an important kinase in Cx43 distribution, and ILK is an important upstream kinases Akt. Then, we hypothesized that ILK plays the role of anti- reperfusion arrhythmia effect, which might be related to the inhibition of Cx43 remodeling via Akt activation. We will research the protection mechanism of ILK on I/R arrhythmia by the model of I/R, gene transfection, immunofluorescence and immunoprecipitation technology, focusing on altering the activity or expression of ILK on effect of Cx43 distribution and how to regulate the Cx43 distribution. This study is hoped to deepen the understanding of the mechanisms of I/R arrhythmias, as to provide new therapeutic targets and prevention strategies for the treatment of I/R arrhythmias.arrhythmias, as to provide new therapeutic targets and prevention strategies for the treatment of I/R arrhythmias.

缺血再灌注心律失常是心肌梗塞常见现象，其危害巨大，但其发生机制尚不十分清楚。我们的前期研究发现激活ILK可预防缺血再灌注心律失常的发生，并抑制心肌缝隙连接蛋白43（connexin 43，Cx43）重塑，但具体机制尚不清楚。鉴于Cx43再分布是再灌注心律失常发生的基础，RISK通路中的Akt是调控Cx43分布的重要激酶，而ILK是Akt的重要上游激酶，我们推测“ILK可能通过Akt作用于Cx43发挥抗再灌注心律失常的作用”。为此本课题拟利用大鼠心脏缺血再灌注模型，采用基因转染、免疫荧光、免疫共沉淀等技术，研究ILK保护缺血再灌注心律失常的机制，重点研究改变ILK活性及表达改变后缺血再灌注心脏Cx43的分布情况及ILK如何调控Cx43的分布，进而保护再灌注心律失常。希望通过此研究深化对心肌缺血再灌注心律失常机制的认识，为心肌缺血再灌注心律失常的治疗寻找新的治疗靶点和防治策略。

缺血再灌注(I/R)室性心律失常发生率高，危害大，整合素连接激酶 (integrin-linked kinase, I L K)在心脏结构、功能的调节以及心脏疾病（如心室肥厚、心肌病、心梗等）中具有重要的调节作用，但在I/R室性心律失常中的作用及可能机制未见报道。方法：我们采用Langendorff系统构建离体心脏缺血再灌注心律失常模型，给予ILK激动剂LPTP、抑制剂Cpd22预处理心脏，记录并观察比较各组心律失常发生情况，对5组心脏组织分别提取组织蛋白，采用蛋白印迹法检测C x 43蛋白表达水平的改变，同时通过免疫荧光法检测Cx43的分布，采用蛋白印迹法检测p-Akt473位点的表达情况，明确予ILK活性调节剂预处理后p-Akt473 的改变情况；给予Akt抑制剂MK2206阻断Akt，观察各组再灌注室性心律失常的发生情况，并提取各组心脏组织蛋白，检测各组Cx43及p-Akt473 的表达情况和Cx43的分布情况。结果发现：抑制ILK显著加重心脏缺血再灌注室性心律失常发生；ILK激动剂可明显减轻再灌注室性心律失常的严重程度，而且该效果可被ILK抑制剂所消除；ILK活性调节剂预处理后各组心肌组织总的Cx43的蛋白表达水平无明显改变，ILK激动剂可稳定心脏缺血再灌注后Cx43在闰盘处的分布，ILK抑制剂可促进心脏缺血再灌注后Cx43的侧面化，并阻断ILK激动剂抑制Cx43重新分布的作用；Akt抑制剂预处理后再予ILK激动剂处理发现，Akt抑制剂可拮抗ILK激动剂的抗缺血再灌注室性心律失常的作用，同时阻断ILK激动剂稳定Cx43闰盘分布的作用。结论：1. ILK具有改善大鼠缺血再灌注室性心律失常的作用；2. ILK发挥抗心律失常的机制与抑制Cx43重新分布有关；3. ILK抑制Cx43重新分布通过激活Akt473位点的磷酸化来实现。