水牛植入前胚胎体外培养过程中抗氧化损伤机制的研究

β-巯基乙醇（β-ME）是一种大分子量的硫醇化合物，在哺乳动物胚胎体外生产过程中添加合适浓度的β-ME具有广谱性抗氧化损伤作用，能够显著提高体外胚胎的生产效率和胚胎质量。水牛在我国南方农业产业结构中占有非常重要的地位，奶水牛产业的发展已经列入国家"十一五"发展规划，广西也把水牛奶业开发项目列为全区的七个重大项目之一。本项目设想以广西特色优势的大家畜- - 水牛为研究的切入点，在水牛卵母细胞体外成熟和（或）胚胎体外培养阶段添加不同浓度的β-ME，比较分析其对水牛植入前胚胎体外发育过程中基因表达的影响和变化，推测β-ME在水牛胚胎体外培养的高氧压环境下参与抗氧化损伤和清除氧自由基的可能机制和参与的相关基因，探索优化水牛胚胎体外培养体系、提高水牛胚胎体外生产的效率，为水牛良种快速扩繁提供理论和实验依据，对加快我国水牛品种改良进程、推进水牛奶产业发展具有重要作用。

哺乳动物胚胎体外生产过程中的高氧压环境会对卵母细胞体外成熟、体外受精和胚胎体外发育造成严重的DNA损伤，影响胚胎体外生产的效率。因此，在胚胎体外发育过程中，通过增加还原性谷胱甘肽（GSH）的含量来改善卵母细胞或胚胎细胞内氧化还原状态非常重要。β-巯基乙醇（2-ME）是一种低分子的硫醇化合物，该类化合物在哺乳动物胚胎体外生产过程中添加能够显著提高成熟后卵母细胞的质量和胚胎发育的潜能（囊胚率显著升高）。该类化合物对胚胎发育的影响主要是通过提升胞质内GSH的含量来实现的。我们早期的研究结果证实：水牛胚胎体外生产体系中添加一定浓度的2-ME（50μM）可以提高胚胎发育至囊胚的比率，获得的胚胎移植后亦可以产下健康的水牛犊，但是没有进行进一步的研究。因此，深入了解2-ME对植入前水牛胚胎体外的影响，特别是胚胎早期发育过程中发育与凋亡相关基因表达变化，可以使我们更清楚地了解哺乳动物胚胎细胞对自由基防范的分子机制，从而设计出更好的体外培养系统，进一步提高当前水牛胚胎胚胎体外生产的效率。. 因此，本项目设想以广西特色的大家畜——水牛为研究的切入点，通过对屠宰场来源的卵母细胞添加不同浓度的2-ME分组进行体外成熟培养后，进行体外受精并培养至孵化囊胚阶段，并对水牛植入前胚胎体外发育过程中基因表达的变化分析，推测2-ME对胚胎体外发育促进作用的机制。然后在此基础上，比较分析活体采卵——体外受精（OPU-IVF）、克隆和转基因克隆胚胎的移植效果及对个体发育的影响，为进一步优化培养体系提高水牛胚胎体外生产的效率，为水牛良种快速扩繁提供理论和实验依据。. 研究结果表明适宜浓度的2-ME不仅能够显著提高提高水牛卵丘-卵母细胞复合体的细胞抗氧化活性，而且显著提高了水牛胚胎体外生产的囊胚率，同时，对胚胎的质量和抗冻能力没有影响，证实了2-ME对水牛植入前胚胎抗氧化的正面效果；进一步通过基因表达差异比较分析，获得了水牛卵母细胞体外成熟和胚胎体外培养过程中的一些基因表达水平存在差异，推测P21基因在水牛卵母细胞成熟阶段起到重要作用，而GSR对囊胚扩张和囊胚细胞增值起上调作用，高浓度的2-ME产生细胞毒性，诱导胚胎细胞在桑椹胚后加速凋亡；生产的胚胎移植后产下了健康的水牛犊，获得了世界首例转基因克隆摩拉水牛雌犊，取得了较好的研究结果。