糖代谢通路调控失衡介导的组蛋白过度乙酰化致DKD肾损伤及黄葵素干预作用的研究

In the context of diabetes，epigenetic mechanism of histone over-acetylation amplify the renal damage of TGF-β and promote excessive secretion of ECM,which may be a key event in the development of diabetic kidney disease(DKD). This pathway is regulated by citrate lyase (ACL),protein kinase B (Akt),histone acetyltransferase p300 (HATp300) in the glucose metabolism pathway. Studies have shown that flavonoids have a role in inhibiting HAT activity, thereby inhibiting histone over-acetylation. So we hypothesize: Flavonoids extract of Abelmoschus esculentus(total flavonoids of Abelmoschus esculentus)may play a role of renal protection by controlling the above-mentioned enzyme activities to influence the epigenetic mechanism; These lead our research to verify the hypothesis in cell and the whole level. Study one: to observe the relationship between Akt/ACL,p300 and histone H3/H4 acetylation in the diabetic mice of db/db and the intervention effect of flavonoids extract of Abelmoschus esculentus. Two:to observe the relationship between Akt/ACL,p300 and histone H3/H4 acetylation in human renal tubular epithelial cells (HK-2) and the effect of flavonoids extract of Abelmoschus esculentus in vitro, also analyze time-effect and dose-effect relationship. In this study, Akt, ACL and p300 are overexpressed by lentiviral vector technique, and the binding ability of H3 and H4 with nucleic acid are detected by ChIP technique.

糖尿病背景下，表观遗传学机制组蛋白过度乙酰化放大了TGF-β炎症信号、促使ECM过量分泌，这可能是糖尿病肾病（DKD）发生发展的关键事件。该途径受葡萄糖代谢通路中柠檬酸裂解酶（ACL）、蛋白激酶B（Akt）、组蛋白乙酰基转移酶P300（HATp300）调控。研究表明，黄酮类化合物具有抑制HAT活性的作用，可抑制组蛋白过度乙酰化。我们推测：黄葵素（黄葵总黄酮）可能通过调控上述酶活性减轻表观遗传修饰而发挥肾保护作用，本课题拟在细胞及整体水平验证这一设想。研究一：观察db/db糖尿病小鼠肾脏Akt/ACL、p300与组蛋白H3/H4乙酰化之间的关系及黄葵素的作用。二：高糖培养观察肾小管上皮细胞（HK-2）Akt/ACL、p300与组蛋白H3/H4乙酰化之间的关系及黄葵素的作用，分析量效和时效关系。研究采用慢病毒载体技术使Akt、ACL、p300过表达，ChIP技术检测H3/H4与核酸结合能力。

背景：糖尿病背景下，表观遗传学机制组蛋白过度乙酰化放大了TGF-β炎症信号、促使ECM过量分泌，这可能是糖尿病肾病（DKD）发生发展的关键事件。该途径受葡萄糖代谢通路中蛋白激酶B（Akt）、柠檬酸酸裂解酶（ACLY）、组蛋白乙酰基转移酶P300（HATp300）调控。植物中存在多种天然蛋白乙酰化调节剂。黄葵素即黄蜀葵花总黄酮，其黄酮类化合物含量达60%以上。我们推测，黄葵素可能影响HATp300活性及蛋白激酶B（Akt）、柠檬酸酸裂解酶（ACLY）表达，下调组蛋白乙酰化水平。..内容：1.观察db/db糖尿病小鼠肾脏Akt/ACLY、p300与组蛋白乙酰化之间的关系及黄葵素的作用。2.高糖培养观察肾小管上皮细胞（HK-2）Akt/ACLY、p300与组蛋白乙酰化之间的关系及金丝桃苷（黄葵素主要成分之一）的作用，分析量效和时效关系。研究采用慢病毒载体技术使Akt、ACLY过表达，ChIP技术检测组蛋白˙H3K9/18Ac与炎症因子的结合能力。..结果： 1.黄葵素对 db/db 小鼠的抗炎、抗纤维化肾保护作用，独立于降糖、降脂之外。2.黄葵素抑制 db/db 小鼠 H3K9/18Ac水平，减轻糖尿病肾脏炎症纤维化改变，降低 H3K9/18Ac 在相关促炎及促纤维化因子启动子区的募集水平，从而抑制促炎及促纤维化因子的转录表达，呈剂量依赖性；金丝桃苷可降低高糖刺激下 HK-2 细胞H3K9/18Ac表达，降低 H3K9/18Ac 在相关促炎及促纤维化因子启动子区的募集水平，从而抑制促炎及促纤维化因子的转录表达，呈浓度依赖性。3.黄葵素及其有效成分金丝桃苷这种保护作用是通过 Akt/ACLY 通路失活，同时降低p300/CBP的表达及 HATs 活性，从而抑制 H3K9/18Ac 组蛋白乙酰化参与的“代谢记忆”多靶点、多环节整合起效实现的。..科学意义：1.本项目对黄葵素及其有效成分金丝桃苷抑制Akt/ACLY 通路活性及 p300/CBP 介导的组蛋白 H3 过度乙酰化，从表观遗传层面防治的效应机制进行探索与阐明；2.减轻“代谢记忆”的阻碍，逆转表观遗传修饰在DKD治疗中可能代表一种全新的治疗策略。3.中医药是一座伟大的宝库，可进一步从表观遗传修饰的角度进行筛选，挖掘治疗慢性疾病的中药及有效成分，有助于阐明中药的药效机制及中医药现代化的科学内涵。.