非小细胞肺癌患者肿瘤细胞通过外泌体影响树突状细胞功能及其机制的研究

To escape immunological surveillance, tumor cells secrete various types of soluble mediators to affect the immune function of host. Dendritic cell (DC) is a bridge between innate and adaptive immune system, and thus plays an important role in anti-tumor immune response. Previous studies reported the DC is suppressed in non-small cell lung cancer (NSCLC), but the underlying mechanisms remains unknown. We recently found that miR-146a was significantly increased in the circulating exosomes of NSCLC, but the biological effects of increased miR-146a were unknown. Given the fact that miR-146a controls the maturation and activation of DC, and the serum from lung cancer patients impairs the differentiation and activation of DC, we hypothesized that: NSCLC cells secrete exosomes which are rich of miR-146a, and these exosomes can be ingested by DC, thus increasing the level of miR-146a in DC. Increased miR-146a in DC negatively affects the maturation and activation of DC via targeting TRAF6, IRAK1 and IRAK2, thus impairing the anti-tumor activity of DC. In this project, we plan to test this hypothesis using flow cytometry, transwell and western blot.

肿瘤细胞通过分泌各种可溶性分子影响宿主免疫功能，以达到逃避免疫监视的目的。树突状细胞(DC)是连接固有免疫和获得性免疫的枢纽，在抗肿瘤免疫反应中处于十分重要的位置。既往研究表明非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织内的DC功能缺陷，但其分子机制尚不清楚。申请者前期发现NSCLC患者血清外泌体内miR-146a表达较健康个体增高，但其生物学功能尚不明确。鉴于以往的研究发现miR-146a可以影响DC成熟和活化，且用肺癌患者的血清培养DC会导致细胞功能缺陷，申请者提出如下假说：NSCLC患者的肿瘤细胞分泌了富含miR-146a的外泌体，外泌体被DC摄取后会导致胞内miR-146a增高。这些miR-146a通过作用于TRAF6、IRAK1和IRAK2等分子而负向调节了DC的成熟和活化，并由此削弱了DC的抗肿瘤功能。本研究拟采用流式细胞术、Transwell、免疫印迹法等验证上述假说。

非小细胞肺癌(NSCLC)居高不下，严重威胁人类健康。NSCLC微环境中肿瘤细胞与基质细胞的相互作用在很大程度上会决定NSCLC的预后。既往研究表明NSCLC肿瘤细胞可以通过释放外泌体的方式影响基质细胞的功能，营造出有利于自身生长的微环境。本课题拟从NSCLC细胞释放的外泌体源性microRNA影响肿瘤相关巨噬细胞(TAM)极化的角度研究肺癌微环境与肺癌进展的关系。.经过多次探索，我们建立了研究假说：NSCLC细胞释放的外泌体中富含miR-146a，这种外泌体可以被肿瘤微环境中的巨噬细胞摄取。摄取了外泌体的巨噬细胞向M1极化的能力被削弱，抗肿瘤的功能被抑制，最终导致肺癌进展。为验证该假说，我们首先采用超高速离心分离得到了H1299细胞(NSCLC细胞系)释放的外泌体，并采用PKH67染色技术证实这些外泌体可以被巨噬细胞(PMA刺激的THP-1细胞)摄取。RT-PCR技术也证实巨噬细胞摄取这些外泌体后胞内miR-146a的丰度得到了提升。采用经过流式细胞术、RT-PCR等技术，我们证实了这些外泌体可以抑制巨噬细胞的M1极化。我们接着用摄取了外泌体的巨噬细胞的条件培养基培养A549细胞，发现细胞的增殖、迁移、侵袭能力增强，凋亡能力被削弱。这些实验证明了巨噬细胞在摄取了来自NSCLC细胞的外泌体后，抗肿瘤能力会被削弱。我们通过向A549细胞转染miR-146a mimic和inhibitor的方式，证实了巨噬细胞抗肿瘤功能的减弱与外泌体上调胞内miR-146a的表达有关，同时采用siRNA技术证实了外泌体源性miR-146a通过下调IRAK1和TRAF6的表达而抑制巨噬细胞向M1细胞极化，最终削弱了其的肿瘤功能。.此外，课题组还对恶性胸腔积液积液(多数由肺癌引起)的诊断标志物以及sortilin在NSCLC发病机制中的作用进行了探讨。在三种肿瘤细胞系中发现下调sortilin的表达可以抑制肺癌细胞的迁移和侵袭能力，同时采用生物信息学手段证实了sortilin是miR-146a的潜在作用靶点之一，相关的分子机制研究目前正在进行中，课题组成员正在以此作为前期基础，积极申请相关科学基金的资助。.本研究从外泌体源性microRNA的角度揭示了NSCLC一种新的免疫逃避机制，为NSCLC的免疫干预治疗提供了新的思路。