基因工程抗体用于农药残留检测的研究

农药残留不仅造成了严重的环境污染、食品污染和生态破坏，还对我国的进出口贸易造成巨大损失，因此对于农药残留检测具有重要意义。与其它方法相比，免疫分析法具有特异性好、灵敏度高、操作方便、对仪器依赖性低等显著优点，一直是一种重要的农药残留分析方法。抗体是免疫分析中的关键因素，传统的抗体制备方法耗时、耗力、花费昂贵，而抗体库技术提供了一种可以简便、快速、高效获得抗体的方法。本研究将利用亚胺硫磷、速灭威、氰戊菊酯合成半抗原，与载体蛋白连接成为免疫原并免疫小鼠，构建T7噬菌体展示单链抗体库，同时以非免疫小鼠构建非免疫抗体库；然后利用与其它载体蛋白偶联的亚胺硫磷、速灭威、氰戊菊酯作为配体来筛选免疫抗体库和非免疫抗体库，以获得三种农药的特异性单链抗体基因；再利用原核、真核重组表达系统，获得三种农药的基因工程抗体；在此基础上，建立三种农药快速、准确、灵敏的酶联免疫检测方法。

近年来，农药残留不仅造成了严重的环境污染、食品污染和生态破坏，还对我国的进出口贸易造成巨大损失，因此对于农药残留检测具有重要意义。基因工程抗体具有重复性好、制备方便等优势，对于农药免疫检测方法的发展具有重要的推动作用。本研究利用噬菌体抗体库技术，对亚胺硫磷、速灭威、氰戊菊酯和速灭威基因工程抗体的制备和应用进行了探索，具体研究内容包括以下方面。以非免疫的Balb/C小鼠为研究对象，设计并合成了高多样性的兼并引物，成功构建了库容为1.74e7pfu的非免疫T7噬菌体抗体库， PCR验证结果显示抗体库的重组正确率达90%，随机测序结果显示抗体具有丰富的多样性，表明构建的非免抗体库具有较高的质量，可用于特异性底物抗体的筛选。在计算机辅助设计下，分别合成了亚胺硫磷、速灭威、氰戊菊酯以及西维因的小分子半抗原并制备了免疫原，免疫Balb/C小鼠后，利用高丰度兼并引物，成功构建了T7噬菌体抗体库，抗体库原始库容分别达到1.5e5、1.1e5、3.26e6和1.74e7 pfu，扩增后抗体库的滴度均能够达到1e11 pfu/mL以上。此外，为了提高获得高亲和性、高特异性基因工程抗体的几率，本项目还利用免疫后的小鼠以及实验室制备的单克隆杂交瘤，成功构建了亚胺硫磷、速灭威、氰戊菊酯的M13噬菌体抗体库，亚胺硫磷与速灭威抗体库的原始滴度分别达到2.0e5和4e4 pfu，氰戊菊酯脾脏来源抗体库和细胞来源抗体库的滴度分别达到5.0e6和2.3e7 pfu。利用以上小分子农药的包被原对抗体库进行淘选，共获得3个氰戊菊酯的单链抗体基因，其中2个抗体由119个氨基酸的重链可变区和108个氨基酸构成，另外一个抗体由116个氨基酸的重链可变区和107个氨基酸的轻链可变区构成。获得2个西维因的抗体基因，分别编码128个氨基酸的轻链可变区和98个氨基酸的重链可变区、112个氨基酸的轻链可变区和112个氨基酸的重链可变区。利用原核表达系统对单链抗体基因进行了重组表达、并利用和亲和纯化系统进行抗体纯化，获得大小为30kDa左右的单链抗体。利用竞争ELISA对抗体活性进行检测，结果显示，1mg/mL的氰戊菊酯对其单链抗体的抑制率为75.9%，0.1mg/mL的西维因对其单链抗体的抑制率为53.8%，显示出一定的亲和性与特异性。本研究的开展，为小分子有害物质基因工程抗体的开发、应用奠定了良好的基础。