下丘脑中Rcan2调控摄食和促进体重增长的分子机制研究

虽然体重被认为是受下丘脑瘦素信号通路的严格调控，近几十年来肥胖却在全球大规模发生。这种现象被称之为瘦素抵抗导致的。申请者偶然发现Rcan2基因敲除小鼠由于摄食量的减少而能抵抗年龄及高脂肪食物引起的肥胖。Rcan2基因由两种转录起始位点不同的剪切变体组成，突出表达于下丘脑调控摄食及体重的神经核团，其中Rcan2-3剪切变体的表达在饥饿过程中上调并作用于饥饿引起的过度摄食行为。申请者进一步证明了Rcan2和瘦素经过不同的信号通路调节体重。因此申请者提出可能存在一种依赖于Rcan2的机制，它增加摄食并在肥胖发生中起重要作用，但不受瘦素通路的调控。本研究将进一步确定这种依赖于Rcan2的机制，包括：1，明确Rcan2的哪一种剪切体突出表达于调控摄食的神经核团；2，确定下丘脑中调控Rcan2表达的上游分子；3，筛选并鉴定下丘脑中Rcan2调控的靶基因。本研究将增加我们对体重调控及肥胖发生机制的了解。

近几十年来肥胖在全球爆发，严重地影响人类的健康。肥胖的爆发被认为是遗传因素与环境因素相互作用的结果，流行病学的研究表明肥胖的发生与营养过剩相关，但对其中的遗传因素了解甚少。我们首次发现可能存在一种依赖于Rcan2基因的机制：它以固定的方式增加摄食并促进体重增加，在年龄及高能量食物引起的肥胖发生中起重要的作用。.本研究进一步确定这种依赖Rcan2的体重调节机制的组成：一、通过酵母双杂交筛选与Rcan2-3相互作用的基因：Rcan2-3剪切变体在饥饿中表达上调，并作用于饥饿引起的过度摄食行为。我们构建了pGBKT7-Rcan2-3质粒，然后用构建好的质粒转化Y2HGold 酵母菌。转化后的Y2HGold菌与转化有均一化的小鼠脑文库（Mate & PlateTM library, Clontech）的Y187酵母菌混合进行双杂交筛选，两种酵母菌的接合效率为5.4 %。在SD/-Leu/-Trp/AbA平板上共筛选了约320万个酵母克隆。我们对阳性克隆中的插入基因进行分析，发现其中一种为Bbs12基因（NM_001255992），其突变虽然导致Bardet-Biedl 综合症，但该综合症也伴有肥胖的症状；而另外一种插入基因为未知功能的小鼠下丘脑cDNA（AK138375）。我们将它们的编码序列插入到pCMV-Tag4质粒中，同时将Rcan2-3的编码序列插入到pCMV-Tag3质粒，然后分别将两种构建好的质粒共转染到293T细胞中。我们正通过免疫共沉淀的方法检测Rcan2-3与这两种基因的相互作用。二、检测p70S6K1基因是否是下丘脑中调控Rcan2表达的上游基因。已有报道p70S6K1基因是甲状腺激素上调Rcan2-3表达所经信号通路的组成分子，并且p70S6K1基因敲除小鼠与Rcan2基因敲除小鼠的表现型类似，因此我们推测p70S6K1基因可能是下丘脑中调控Rcan2表达的上游基因。然而，我们检测发现p70S6K1基因的敲除并没有影响Rcan2的两种剪切变体在下丘脑中的表达。我们正检测p70S6K1基因的敲除是否影响了饥饿过程中Rcan2基因的表达变化。此外，我们还在监测Rcan2基因敲除小鼠、p70S6K1基因敲除小鼠以及双基因敲除小鼠的体重生长曲线，进一步判断Rcan2基因和p70S6K1基因是否是通过同一体重调节机制影响体重。