锌离子在产肠毒素大肠杆菌F4ac菌毛及其受体猪氨肽酶N互作中的调控作用研究

Zinc ion (Zn²﹢) is an essential trace element and involved in numerous aspects of life. It also affects the host bacterial infections. Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) F4ac is a major determinant of neonatal and post-weaning diarrhea (PWD) in piglets. Previous study demonstrated that porcine aminopeptidase N (APN) is a receptor protein for F4ac fimbriae, and mediated the endocytosis of F4ac bacteria in the host cells. The change of Zn²﹢concentrations affect the biological activity of APN protein and the adherence between F4ac E .coli and the host intestinal epithelial cells. Zinc is likely to be a potential inter-kingdom signal between host and pathogen. However, the mechanisms of F4ac transport Zn²﹢to regulate the biological activity of APN and promote F4ac infection in intestinal epithelial cells remanis to be probed. In order to clarify the effects of Zn²﹢on F4ac pathogenesis, we studied the Zur-ZnuABC systems and its functions. Under different zinc ion concentrations, we analyzed the biological activity of APN protein, the adherence between F4ac and the intestinal epithelial cells, and the mechanism of APN-mediated endocytosis in cells. This study may further elucidate the roles of zinc ion upon F4ac infection in the host intestinal, and provide new strategies and ideas to control and prevent F4ac E. coli infections.

锌离子（Zn²﹢）是生物体必需的微量元素之一，参与调节多种生命活动，并能影响细菌对宿主的感染。产肠毒素大肠杆菌F4ac是导致新生和断奶仔猪腹泻的重要病原菌。前期研究发现，猪源氨肽酶N（APN）是F4ac菌毛蛋白的直接受体，介导宿主细胞内吞细菌。Zn²﹢浓度变化不仅影响APN的生物学活性，而且能影响F4ac对肠上皮细胞的黏附，是潜在的宿主和病原微生物间的界间信号物质（inter-kingdom signal）。但F4ac通过转运Zn²﹢调控APN生物学活性，促进对肠上皮细胞入侵的机制有待深入探索。本研究通过解析Zur-ZnuABC转运系统及其功能，阐明Zn²﹢对F4ac致病性的调控作用；分析不同浓度的Zn²﹢对APN生物学活性和F4ac黏附肠上皮细胞的影响，明晰APN介导细胞内吞F4ac的作用机制。上述研究旨在解析Zn²﹢对宿主肠道感染F4ac的调控作用，为防控F4ac感染提供新的策略和思路

产肠毒素大肠杆菌ETEC F4ac是导致新生和断奶仔猪腹泻的重要病原菌，其致病性主要由两个因素决定，一是菌体在宿主小肠上皮细胞的黏附、定植能力，二是细菌产生肠毒素的能力。猪氨肽酶N（APN）是ETEC F4ac菌毛的受体蛋白，能够介导F4ac菌毛特异性结合猪小肠黏膜上皮细胞，并促进肠上皮细胞对F4ac大肠杆菌的内吞，继而引发感染。而锌离子（Zn2+）的浓度变化不仅能够改变APN的生物学活性，还能影响ETEC F4ac的体外黏附。这说明，Zn2+这种生物体必需的微量元素，也是宿主和病原菌互作中一种潜在的界间信号物质（inter-kingdom signal）。但F4ac大肠杆菌ZnuACB锌转运系统的功能，Zn2+对F4ac致病性的调控作用，以及一定浓度范围内的Zn2+影响APN内吞细菌的作用机制尚不清楚。.本研究以Zn2+、F4ac大肠杆菌及其受体蛋白APN三者之间的关系作为切入点：利用λ-Red同源重组技术构建F4ac大肠杆菌ZnuACB转运基因的缺失株和回补株，结合转录组学分析结果，明确不同Zn2+条件下，ZnuACB系统对细菌黏附和其他毒力因子表达的影响，证明ZnuACB系统是ETEC F4ac在低锌环境中维持细菌黏附和毒力因子表达的关键。在APN与FaeG（F4ac菌毛主要亚单位）发生直接蛋白互作的前提下，通过多肽阵列高通量筛选，结合生物信息学分析和体内、外实验验证，明确影响两个蛋白互作的关键位点，包括F4ac FaeG蛋白的N209和L212位氨基酸残基，以及APN蛋白的226–244，553–568，580–598，652–670和901–916位氨基酸。在此基础上，筛选出APN蛋白的14个关键位点，表达相应的突变体蛋白并构建点突变稳定表达细胞系，结合APN酶活性和蛋白表达量检测，以及流式细胞术分析结果，证明Zn2+影响下，APN不同位点突变体内吞F4ac细菌的能力具有明显差异。上述研究有助于深入了解Zn2+在ETEC F4ac和宿主受体蛋白APN互作中的调控作用，解析Zn2+参与下宿主肠道感染ETEC F4ac的作用机理，并为防控F4ac感染提供了新的策略和思路。.