转录调控因子在pqqA转录激活和PQQ快速合成过程中的应答机制

Pyrroloquinoline quinone is the third class of coenzyme and a newly discovered vitamin, which exerts physiological functions in prevention and cure hepatic injury, promoting growth of NGF, balancing the free radical, protecting cells from radiation injuries. As a result, PQQ is a promising candidate drug in therapy. Methylovorus sp. MP688 can syntheisi a relative high leve of PQQ. A small peptide PqqA encoded by gene pqqA is the precursor and substrate of PQQ. Experiment results indicate that large-scale production of PQQ requires a high lever transcription of pqqA gene. And pqqA was effectively induced in lower pH, lower dissolval oxygen and calcium concentration. Deletion analysis revealed a DNA region inhibiting pqqA transcription. After that, putative transcriptional regulators were isolated by biochemical and genetic method. This research focus on the transcription regulator, either positive or negative, of pqqA gene by using comparative genomics, protein-protein interaction and genetic methods. Furthermore, we study how the regulator response to the signals, causing the signal transduction and effecting at the target DNA sequences. On the basis of elucidating the transcriptional regulation mechanism of pqqA gene, we will make some improvement of the PQQ-producing strain in order to enhance the production. The study is instructive to clarify the regular mechanism of secondary metabolites synthesis and microbial genetic breeding.

吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone,PQQ）是细菌的第三类氧化还原辅酶，具有重要的生理功能和药用开发价值。Methylovorus sp.MP688是极具产业化前景的PQQ生产菌，基因簇pqqABCDE是PQQ合成的遗传基础，其中pqqA编码的小蛋白是PQQ合成的直接底物。实验发现PQQ高效合成的前提是pqqA的高效表达；而细菌生长时pqqA只维持着基础转录，在复杂的胞外信号如低pH、低溶氧、低钙等条件下才能被高效诱导；启动子截短发现了一段抑制pqqA转录的DNA区域，进而通过生化分离和遗传学手段鉴定了转录调控蛋白。本研究通过比较蛋白组学、蛋白质相互作用、分子遗传学等方法考察转录调控因子特征及在胞外信号作用下调节基因转录的方式和差别，阐明其在pqqA转录激活和PQQ快速合成过程中的作用机制，为构建pqqA基因持续高效转录的菌株和最终提高PQQ水平提供理论依据。

PQQ具有重要的生理功能和药用开发价值。Methylovorus sp.MP688是极具产业化前景的PQQ生产菌，基因簇pqqABCDE是PQQ合成的遗传基础，PQQ高效合成的前提是pqqA的高效表达，研究pqqA基因的转录调控蛋白及其调控方式对于揭示PQQ高产至关重要。本研究通过转录组测序、比较蛋白组学、蛋白质相互作用、分子遗传学等方法考察了PQQ合成基因转录调控关键因素及在胞外信号作用下基因转录的方式和差别。鉴定了一个由tcs1/tcs2基因组成的双组分转录调控系统和一个由qsr-like基因编码的转录因子，证明了这两个系统调控着pqqA基因在高产状态下的转录水平，构成PQQ快速高效合成的分子开关。任何一个基因缺失均造成PQQ合成水平显著降低，对多种胞外诱发高产的信号失去响应，双组分系统的缺失导致PQQ合成基因转录水平也大幅度下降。tcs2和qsr-like基因与pqqA基因的启动子通过直接的相互作用调控基因转录。从pqqA2基因的启动子PpqqA2入手，对全长的PpqqA2启动子进行了扫描式突变，发现启动子的三个区域位点突变后，启动子活性明显降低，转录调控蛋白失去了结合位点，PQQ合成水平降低；两个区域位点发生改变后，启动子活性增强。获得了比天然启动子更强的启动子突变体PA13/26，突变体在两种培养条件下表达水平的差异也明显缩小。Ca2+作为pqqA2基因转录的诱导因素，诱导PpqqA2启动子产生较高活性。在低产菌体培养物中发现了一种脂溶性物质，能够刺激菌体生长且抑制PQQ合成的，鉴定结果与双组分系统以N-乙酰高丝氨酸内酯（AHL）为信号分子进行群体感应调控行为一致。Tcs2属于LuxR家族成员，利用密度感应系统调控细菌群体行为。根据目前结果，我们得出发酵过程中pqqA基因持续高效转录的调控模型：磷酸化的Tcs2激活PQQ合成基因pqqA和pqqBCDE转录，导致PQQ合成快速合成，同时阻遏AHL合成基因MPQ_1458的转录，使AHL的合成处于较低水平。在低产条件菌体生长良好，AHL逐渐积累，菌体迅速生长，同时关闭PQQ的合成。截止目前，本项研究基本阐明了PQQ快速高效合成的发酵过程中pqqA基因转录激活的调控蛋白及信号分子，找到了影响PQQ快速合成过程关键因素，为构建pqqA基因持续高效转录的菌株和最终提高PQQ水平提供理论依据，具有重要的理论和应用意义