细菌群体感应系统、转录调节因子RpoN和RpoS在调节聚羟基脂肪酸酯生物合成过程中交互关系的研究

细菌群体感应可能参与细菌合成聚羟基脂肪酸酯的调节。转录调节因子RpoN和RpoS是细菌响应多种环境条件变化进而调节相关基因表达的关键因子。本研究以铜绿假单孢菌PAO1为材料，构建其群体感应系统各组分如lasI/lasR、rhlI/rhlR和转录调节因子rpoN和rpoS突变株和恢复突变株，导入PHA生物合成相关基因phaC1，phaZ，phaF，phaI启动子控制下的lacZ转录融合报告基因，以PHA积累量、phaC1，phaZ，phaF，phaI的表达量及其启动子活性为检测指标，采用生理生化和分子生物学技术系统研究QS系统对菌体生物合成PHA的影响以及rpoN、rpoS和QS系统在调控PHA生物合成过程中的相互关系，获得直接证据，全面解析转录因子rpoN和rpoS以及QS系统调控PHA合成的分子机制和调控网络，挖掘QS新的生物学功能，为提高PHA的产量和产率提供理论指导。

细菌胞内合成聚羟基脂肪酸酯（PHA）受多种调控系统如转录调节因子RpoS、双因子调控系统GacA/GacS和群体感应系统（QS）的影响。本研究发现紫色杆菌CV31532 QS信号分子合成酶突变株CV026的PHA积累量显著低于野生型，加外C6-HSL可使突变株PHA积累量恢复到野生型水平。与铜绿假单胞菌野生型PAO1相比，LasI、LasR的突变体及两个基因双突变体的PHA积累量都显著降低，添加LasI对应的信号分子3OC12-HSL，PHA的积累量显著上升。RT-PCR分析显示，添加3OC12-HSL可诱导phaC1的转录。启动子活性分析显示，LasI突变显著降低phaC1的转录。研究发现C4-HSL合成酶基因rhlI缺失突变株PAO210积累PHA的量与野生型无显著差异；添加C4-HSL也不影响菌体合成PHA的能力。荧光假单胞菌2P24是一株生防菌。本研究首次发现该菌株可以利用D-葡萄糖酸钠或辛酸钠为唯一碳源在胞内合成PHA。有趣的是，利用不同碳源合成PHA其调控机制不同。当以D-葡萄糖酸钠为唯一碳源时，2P24转录调节因子RpoS的突变体PM303PHA积累量与野生型相比明显下降，而群体感应信号分子pcoI的突变体PM100PHA积累量与野生型相比明显上升。双组分调控系统GacA和GacS突变体PM201和PM202PHA积累量与野生型相比无显著差异。pcoI基因恢复株的PHA积累量与其突变株相比显著下降，说明pcoI基因负调控PHA的合成，而rpoS恢复株PHA积累量显著上升达到野生型水平，过表达rpoS对菌体合成PHA具有促进作用。rpoS基因对PHA的合成起正调控作用。而双因子调控系统GacA/GacS对PHA的积累无影响。以辛酸钠为单一碳源培养时，PM201、PM202和PM303的PHA积累量与2P24相比明显下降，而PM100的PHA积累量与野生型相比无明显差异。恢复GacA/GacS基因可显著提高菌体积累PHA的量，说明GacA/GacS基因和rpoS基因对PHA的合成起正调控作用,而pcoI基因对PHA的合成无影响。