大黄鱼炎症疾病与巨噬细胞移动抑制因子（MIF）关系的研究

大黄鱼是我国海水网箱养殖单一品种产量最大的鱼类，也是我国8种最具优势出口水产品之一。由于寄生虫和细菌等病原诱发的炎症疾病，不仅给大黄鱼养殖业带来了巨大损失，也严重污染了环境。寻找替代抗生素治疗技术与方法，是我国水产养殖业迫切需要解决的关键科技问题。拮抗细胞因子的分子治疗已成为人类控制疾病的研究热点，而巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是集细胞因子、神经内分泌激素和酶多种效能的炎症调节因子，已成为高等动物重症炎症疾病分子治疗的优良靶标。本项目拟研究大黄鱼MIF克隆与表达、生物学活性与免疫功能，揭示鱼类MIF与炎症疾病关系，阐明MIF调节大黄鱼炎症免疫反应的分子机制；利用大黄鱼MIF抗体展开拮抗MIF方式治疗重症炎症疾病的探索，阐明鱼类炎症疾病拮抗MIF方式分子治疗机制，为开展以MIF为靶标的鱼类炎症疾病的分子治疗方法提供理论依据，为我国水产养殖病害非抗生素防治提出新的途径。

本项目首次在海洋鱼类中系统地研究MIF结构与功能，探讨与MIF具有拮抗作用的IFNG因子拮抗功能，初步阐明鱼类炎症疾病拮抗MIF的分子治疗机制。主要结果如下：.(1)克隆了大黄鱼MIF(LycMIF)基因，发现LycMIF无论在结构上还是进化水平上都高度保守，含有典型的硫醇蛋白氧化还原酶催化活性所需的CALC结构。.(2)重组LycMIF并在大肠杆菌表达，获得纯度达90%的14.5kDa融合蛋白。制备出2种能与MIF抗原高度结合的多克隆抗体(效价达1∶810000)。生物学活性测定表明重组LycMIF能加速胰岛素还原反应，但该反应受pH和GSH浓度影响较大。.(3)研究了炎症疾病发展过程中LycMIF的mRNA和蛋白的组织分布与时空变化，分析了炎症疾病与MIF的关系：①QRT-PCR和免疫组化等表明，LycMIF基因和蛋白在所测组织中呈组成性表达，MIF蛋白的阳性信号主要定位于细胞质。②结合攻毒实验开展了LycMIF与多种炎症病的关系：免疫组化分析表明，患溶藻弧菌溃疡病黄鱼的肝、头肾和肠中MIF蛋白表达量明显高于对照组。ELISA检测表明，感染刺激隐核虫病大黄鱼与健康鱼相比，细胞质MIF浓度有显著升高。.(4)MIF及IFNG对巨噬细胞起着抑制与激活双重作用。LycMIF功能初步拮抗分析，发现MIF重组蛋白能激活巨噬细胞产生NO，而IFNG则能激活头肾细胞的呼吸爆发。对于提高大黄鱼免疫系统的防御能力具有重要作用。.(5)首次探讨了海洋鱼类大黄鱼等的MIF与炎症疾病发生的关系。免疫组化分析结果表明，经弧菌感染的大黄鱼，MIF蛋白肝、肾、脾、性腺、肠道和脑组织中均可表达；用拮抗MIF的IFNG蛋白注射大黄鱼，发现IRF-1，MHC I重链，β-2-微球蛋白，补体系统的B因子和补体2的mRNA表达都有不同程度的上调。.(6)以V.harveyi感染大黄鱼(12cm)，再注射MIF抗体并统计死亡率，实验大黄鱼死亡率明显减少，但不同批次拮抗实验差异较大，统计学上尚未达到显著的效果，可能依靠单一拮抗MIF法尚不足以解决复杂的炎症疾病难题。