tms5靶基因UbL40在水稻花粉发育中的分子机制

Hybrid rice breeding is the main approach to increase the yield potential of rice. Photoperiod- and thermo-sensitive genic male sterility (PGMS and TGMS) lines have been applied widely in two-lines hybrid rice breeding. We found that RNase ZS1 processes ubiquitin fusion ribosomal protein gene UbL40 mRNAs to control thermosensitive genic male sterility in rice. However, the molecular mechanism of UbL40 in TGMS remains obscure. Here, we will elucidate the molecular mechanism of UbL40 and E3 ubiquitin ligase TMS5-RF1 which confers TGMS in rice. Firstly, we will confirm that the ubiquitin part of UbL40 regulates TGMS and is different with polyubiquitin using the method of genetic transformation and cytology. Secondly, we will confirm that the mutation of TMS5-RF1 which may specificity interact with UbL40 restore the pollen fertility of AnS-1 under high temperature. Thirdly, we will analyze the substrates which are recognized by UbL40 and TMS5-RF1 using proteomics and Protein Post-translational Modification proteomics. Finally, we will analyze the function of UbL40 in ubiquitylation and TGMS. Our results will profoundly uncover the mechanism controls TGMS in rice and find some novel mechanisms and functions in the process of ubiquitylation.

杂交水稻是提高水稻产量的主要手段，光/温敏不育系已广泛的应用于两系法杂交水稻。我们已经确定温敏不育基因RNase ZS1通过调控泛素融合基因UbL40控制温敏不育。但是UbL40如何发挥功能是不清楚的。本项目拟通过综合手段揭示UbL40及其互作的E3泛素连接酶TMS5-RF1在水稻温敏不育中的功能。首先通过遗传转化和细胞学观察确认温敏不育中是UbL40的泛素部分在起作用；并且该类泛素不同于多聚泛素，可能只作用于单泛素化。然后确认TMS5-RF1（编码E3泛素连接酶）的突变恢复了安农S-1高温下的育性，并且与UbL40存在直接而特异的互作。进一步通过蛋白质组学和泛素化修饰蛋白质组学分析UbL40和TMS5-RF1共同决定的底物蛋白。最后分析确定UbL40泛素化的可能途径和在温敏不育中的作用。该研究将深度揭示水稻温敏不育的分子机理，发现泛素和泛素化过程中的一些新的机制和功能。

水稻是我国主要的粮食作物也是全世界50%以上人口的主粮。杂交水稻可以提高10-20%的产量，水稻温敏不育系既是两系杂交水稻育种的关键，也是开展植物感应温度的优良材料。前期，我们已经证明温敏不育基因TMS5编码RNase ZS1，特异性降解受温度诱导表达的UbL40的mRNA控制水稻温敏不育。本项目首先初步阐明了UbL40调控的温敏不育的分子机理。UbL40由泛素Ub和核糖体蛋白L40融合而成的基因，通过过量表达不同部分，我们证明Ub的过量表达导致水稻不育，并且Ub可能通过单泛素化靶蛋白调控花粉发育。通过切片证明Ub过表达植株的花粉母细胞出现液泡化，与高温下的安农S-1表型一致，进一步说明TMS5通过调控UbL40控制光/温敏不育。然后，通过Co-IP筛选到916个泛素化靶蛋白，其中有7个泛素化蛋白已经证明参与花粉发育。前期通过对一个安农S-1的恢复突变体tms5-rf1进行精细定位和测序发现一个E3泛素连接酶发生突变。本项目通过遗传转化证明TMS5-RF1编码E3泛素连接酶。TMS5-RF1在花药的绒毡层高表达，并定位于内质网和细胞质中。通过酵母双杂交和Co-IP筛选到17个候选TMS5-RF1的互作蛋白，其中已经证明3个互作蛋白与花粉发育有关。分别对高温和低温下生长的安农S-1和tms5-rf1突变体花粉母细胞时期的颍花蛋白进行蛋白质组和泛素化组学研究，发现TMS5-RF1参与蛋白质泛素化，并且TMS5-RF1可能在高温下的安农S-1中错误的参与了某些花粉发育蛋白的泛素化，导致雄性不育。但是，本项目中，我们发现TMS5-RF1不能直接与UbL40互作。最后，我们通过基因编辑技术编辑TMS5建立了温敏不育系的培育体系。总之，本项目揭示了TMS5-RF1和UbL40通过泛素化花粉发育蛋白调控水稻温敏不育的分子机理。这些工作有利于认识植物对温度的感应机制和促进两系杂交水稻的育种。课题执行期间，申请专利1项，授权专利2项，发表SCI论文3篇，接受SCI论文1篇（Scientific Reports, 2016; Frontier in Plant Sciences, 2018; New Phytologist, 2019; Genomics, Proteomics & Bioinformatics, accepted）。