雄黄干预原癌基因ras突变诱导肺癌的作用及机制研究

Realgar (As4S4), a traditional Chinese medicine of “like cures like”, has been shown to be effective for treating hematologic malignancies and otherforms of cancers. In our previous studies, the results indicated that realgar can intervenetumor resulting from ras mutation by down-regulating Ras/MAPK signal pathway in C.elegans. In view of “like cures like” and early studies, we will infer that realgar could intervene lung cancer resulting from K-rasmutation by down-regulating overactivatedras.To clarify the action mechanism of realgarin“like cures like”for treating K-ras-mutant lung cancer, we will prove the effects on K-ras-mutant lung cancer of realgar by K-ras-mutant lung cancer cell lines and human xenograft tumorsin nude mice. On the basis of that, we will use the genechip, RT-PCR, immunochemistry, western blot to firstly reveal the molecular mechanism of realgar in“like cures like”for treating K-ras-mutant lung cancer. That will provide a theoretical basis for the application of realgar in the treatment of lung cancer and antitumor drug research.

雄黄(As4S4)为传统医学中按“以毒攻毒”法应用历史悠久的中药，临床上用于治疗血液系统及其它部位肿瘤，前期采用秀丽隐杆线虫研究发现雄黄能够通过下调Ras/MAPK信号通路从而显著干预ras突变（过度激活）引起的肿瘤。基于雄黄“以毒攻毒”治法及前期研究，科学的推测雄黄通过下调ras过度激活对K-ras突变诱导肺癌具有干预作用。为了阐明雄黄“以毒攻毒”治法对K-ras突变诱导肺癌的作用机制，本课题体外实验通过采用K-ras(G12V)突变诱导肺癌细胞和体内实验通过采用无胸腺裸鼠构建K-ras(G12V)突变诱导肺癌荷瘤小鼠证明雄黄对K-ras突变诱导肺癌的抗肿瘤活性。在此基础上，采用基因芯片、RT-PCR、免疫组化、westernblot等技术从分子水平上首次揭示雄黄“以毒攻毒”治法在K-ras突变诱导肺癌应用的分子调控机制，为雄黄在治疗肺癌的应用和抗肿瘤新药研发提供一定的理论依据。

背景：肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因。原癌基因 ras 突变在人类恶性肿瘤中比较常见，90%的 ras 基因突变是 K-ras 的突变。前期利用模式生物秀丽隐杆线虫( ( C.elegans ) ) 首次发现雄黄能够干预 ras 突变引起的肿瘤。本课题旨在进一步验证和评价雄黄抗肿瘤活性及其分子调控机制。.材料/方法：选取 KRAS(G12V)突变的肺癌细胞株及非KRAS突变的肺癌细胞株，利用 MTT 法初步筛选雄黄抗肿瘤效果较好的肺癌细胞株，流式细胞仪评估细胞凋亡、活性氧、线粒体膜电位等变化，采用 western blot 检测雄黄对 ras 及其相关信号通路通路以及铁死亡相关蛋白表达量的影响。同时利用秀丽隐杆线虫 ( C.elegans ) 进行探究雄黄的生殖毒性及其机制。.结果：与未处理的肺癌细胞相比，雄黄处理后可抑制细胞增殖，调控细胞周期并诱导细胞凋亡，同时雄黄对KRAS突变的细胞株H23具有选择性。雄黄处理H23细胞 48 小时后能增加P-JNK和P-p38蛋白表达量，抑制P-ERK1/2和P-RAF蛋白水平的表达。此外，雄黄可显著诱导细胞内 Fe2+、MDA 和 ROS 水平的增加，并减少 GSH，这些在体外通过 Fer-1 预处理得以挽救。雄黄降低了铁死亡相关蛋白GPX4、SCL7A11蛋白的表达，并增加了ACSL4蛋白的表达。同时，雄黄转化液在有效的砷抑制ras过度激活的多阴门表型浓度范围内并不会导致生殖毒性，高浓度的雄黄转化液（37.5 μg/ml）诱导线虫性腺细胞凋亡和细胞周期阻滞。MAPK和p53通路调控了雄黄转化液诱导的生殖毒性。.结论：雄黄可以抑制肺癌细胞增殖和诱导肺癌细胞死亡。这些作用受有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途径和铁死亡途径调节。雄黄转化液具有低毒性且MAPK和p53通路调控了其诱导的生殖毒性，砷诱导的生殖毒性直接或者间接地受多种基因的调控而不是某一个特定的基因。