乳酸/GPR81/MCT在非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药中的作用

Molecular targeting drug tyrosine kinase inhibitor (TKI) resistance is critical for treatment failure in non-small cell lung cancer (NSCLC). Lactate plays an important role in shaping the behavior and phenotype of tumor and tumor-related cells, however, the role of lactate in the process of TKI resistance remains unclear. Our previous studies found that lactate targeting its receptor GPR81 could reduce the sensitivity of NSCLC cells to erlotinib via the transmission between TKI sensitive and resistant cells. In this project, NSCLC cells are used and the mouse transplanted tumor model is established. By silencing or overexpression of GPR81/monocarboxylate transporter (MCT), lactate fluxes are vividly traced by nuclear magnetic resonance to illustrate its effects on drug sensitivity to TKI. To identify the energetic and pro-metabolic functions of lactate in TKI resistance, we use fluorescence labeling and cell respiratory dynamic test. Western blot and metabonomics analysis are utilized to delineate the regulatory effects of lactate/GPR81 on the activity of downstream signaling pathways. This study aims to elucidating the role of lactate/GPR81/MCT in TKI resistance and providing novel theoretical evidence and potential therapeutic targets for reversing TKI resistance in NSCLC.

分子靶向药物酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）耐药是非小细胞肺癌（NSCLC）治疗失败的原因之一。乳酸在塑造肿瘤和肿瘤相关细胞行为及表型中发挥重要功能，但在TKI耐药形成中的作用仍不清楚。申请人前期研究发现，乳酸在TKI敏感与耐药细胞间传递，并作用其受体GPR81可降低细胞对厄洛替尼的敏感性。本项目拟以NSCLC细胞为研究对象，建立小鼠移植瘤模型，沉默或过表达GPR81/单羧酸转运蛋白（MCT），同位素标记示踪，原位，实时，动态监测乳酸流，阐明其对NSCLC靶向药物敏感性的影响；利用荧光标记，细胞呼吸动态检测，明确乳酸参与耐药的高能促代谢作用；通过蛋白印迹，代谢组学分析，证实乳酸/GPR81对EGFR下游信号通路的调控。本项目从组织，细胞和分子信号转导水平揭示乳酸及其受体/转运体参与TKI耐药形成的机制，将为临床逆转NSCLC靶向药物耐药提供新的理论依据和潜在治疗靶点。

分子靶向药物酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）耐药是非小细胞肺癌（NSCLC）治疗失败的原因之一。乳酸在塑造肿瘤和肿瘤相关细胞行为及表型中发挥重要功能，但在TKI耐药形成中的作用仍不清楚。本研究意在探索EGFR-TKI耐药的NSCLC细胞通过释放过量乳酸与敏感细胞进行信号传递，分别作用其受体GPR81及转运体MCT1，介导TKI耐药形成的机制。我们首次证实乳酸在TKI耐药及敏感细胞间传递，不仅作为激活EGFR-AKT信号旁路以维持生存的“药物”，还可以成为快速氧化磷酸化的高能底物提供“营养”。研究结果发现2 μM厄洛替尼处理后，H1650细胞（TKI耐药）释放乳酸浓度明显升高，在6小时左右达到高峰。同时，H1650细胞调控乳酸流出的MCT4转运体表达明显升高，提示低浓度厄洛替尼可能激活H1650细胞糖酵解途径增加乳酸释放。使用10 mM乳酸预处理PC9或HCC827细胞（TKI敏感），能够明显降低厄洛替尼对细胞的毒性作用（表现为细胞活性增加，凋亡比例下降）。同时我们发现PC9或HCC827细胞表面GPR81及MCT1表达升高，胞内蛋白AKT明显增加。敲减GPR81表达，AKT蛋白水平降低，并且凋亡率较单独应用10 mM乳酸预处理时升高。使用MCT1抑制剂AZD3965，能够抑制乳酸流入细胞，显著降低HCC827细胞胞外酸化率，从而降低细胞能量代谢及细胞活性。在敲减GPR81的小鼠模型中，我们发现肺肿瘤组织明显缩小，并且AKT表达显著降低。NSCLC患者病理组织样本免疫组化结果提示TKI耐药患者中GPR81及MCT1高表达比例较TKI敏感患者明显升高。综上所述，乳酸结合GPR81受体激活下游AKT信号通路，能够拮抗TKI诱导的细胞凋亡，是TKI耐药形成的旁路途径及关键因素；同时，乳酸还能通过MCT4/MCT1出入细胞，实现信号传递的同时作为高能底物为敏感细胞提供能量补给，进一步降低肿瘤细胞对TKI的敏感性。本项目从组织，细胞和分子信号转导水平揭示乳酸及其受体/转运体参与TKI耐药形成的机制，将为临床逆转NSCLC靶向药物耐药提供新的理论依据和潜在治疗靶点。