对DNA有高度切割活性的烯二炔类药物调控端粒/端粒酶的抗肿瘤分子机制研究

细胞恶变过程中重新获得端粒酶活性是肿瘤形成的关键步骤，可弥补因分裂所致端粒DNA耗损。因此，对与肿瘤无限增殖能力和恶性程度密切相关的端粒/端粒酶同时进行调控有望取得最佳疗效。我们前期发现，有我国自主知识产权的烯二炔力达霉素(LDM)具端粒切割特异性，可诱导人肝癌BEL-7402细胞裂亡，并使细胞端粒酶活性下降，微管牵扯拉长。由于纺锤体是微管构成的结构，推测LDM可能通过端粒/端粒酶途径影响有丝分裂纺锤体功能而诱导细胞裂亡。本项目以LDM为主药，以自主开发且无端粒识别特性的烯二炔calicheamicin为对照药，比较研究其诱导BEL-7402细胞裂亡的特征，并通过研究端粒和端粒酶调控通路关键蛋白表达模式，探讨两种药物通过端粒/端粒酶调控影响有丝分裂纺锤体功能、诱导细胞裂亡的分子机制。该结果可丰富细胞死亡研究内容，为研发烯二炔药物及其抗体药物奠定基础,对肿瘤预防和治疗亦有重要科学和应用价值。

研究发现，烯二炔药物(Lidamycin，LDM)和C3509B（同Calicheamicinγ1I）能够诱导人肝癌细胞裂亡：细胞体积增大，G2+M期阻断、出现多核化；微管牵扯拉长，乙酰化程度增加；线粒体膜电位和活性氧自由基水平升高。灭活G2+M检测点可部分逆转LDM诱导的G2+M期阻滞，促进裂亡。LDM和C3509B通过pRb信号通路呈剂量依赖性诱导细胞衰老，与裂亡存在交叉。.LDM和C3509B诱导细胞裂亡使染色体部分端粒缺失，但不产生明显基因组DNA切割，不改变端粒平均长度，部分端粒长度调节蛋白呈现对抗性表达，端粒功能异常。LDM和C3509B诱导细胞裂亡还激活了细胞ATM和ATR信号途径及DNA损伤修复程序。深入研究发现，LDM和C3509B诱导细胞裂亡使人肝癌细胞不能正常分裂，染色体排列滞后、形成多极纺锤体，中心体过复制；有丝分裂相关蛋白Survivin、Aurora B、Centrin1表达升高，Bub1表达降低，细胞纺锤体检查点无法正常行驶其张力和粘附功能。鉴于DNA损伤反应蛋白参与中心体调控，因此，LDM和C3509B可能通过诱导端粒功能异常，激活DNA损伤信号通路，产生中心体过复制，影响纺锤体检查点功能，导致细胞裂亡。.裂亡浓度LDM和C3509B上调hTERT转录与翻译，促进端粒酶活性，更高浓度则下调端粒酶活性。LDM和C3509B诱导细胞裂亡导致端粒酶蛋白在细胞核部位积聚，NFκB p65和TNFα表达升调节，提示LDM和C3509B诱导端粒酶核定位可能与NFκB/TNFα作用有关。C3509B作用细胞24 h可诱导凋亡和G2+M期阻滞，抑制hTERT转录、翻译及磷酸化，激活pERK通路。抑制pERK表达可加强C3509B对hTERT蛋白表达及磷酸化的抑制。.具有转录抑制作用的抗肿瘤抗生素Mithramycin(MTH)诱导细胞凋亡时虽能抑制人肺癌细胞hTERT转录和翻译，但不能下调其端粒长度和端粒酶活性。MTH诱导细胞凋亡与caspases通路激活有关。基于LDM的烯二炔抗体药物Fv-LDP-AE亦能够诱导肿瘤细胞裂亡。.本项目完成了烯二炔药物通过端粒/端粒酶调控细胞死亡的分子机制研究，发表论文2篇，参加学术会议2次。本项目结果丰富了细胞死亡研究内容，为烯二炔及其抗体药物研发奠定了基础。