miR-488调控小鼠毛色形成机制的研究

Coat color is one of the most important economic characters in wooler and getting more and more attention. Although some factors are known to influence melanocyte pigment production, the regulatory mechanisms of microRNA involved in coat color are complex and not entirely clear.Taking mice as research subject,our research team has screened and selected miR-488 which may affect coat color development by bioinformatics screening method.We construct its eukaryotic expression vector, analyse the regulation mechanisms of overexpression miR-488 to α-MSH gene which determine color development and pigmentation through the Cell transfection technique on cellular level.The effect of overexpression miR-488 on coat color development is observed through preparing transgenic mice on animal experiment level.The influence on melanoctyes development of transgenic mice skin by overexpression miR-488 is studied through immunohistochemistry and laser confocal microscopy technique. With the help of western-bolt, qPCR technique,we are successful to reveal the pigment production pathway of α-MSH/MC1R and the regulatory mechanisms of coat color development on protein and gene level. Our objectives are to abtain artificially interfered C57BL/6 mice, which can produce multi-color wool fiber, and demonstrate a mechanism of miR-488 in the regulation coat color phenotype by miR-488 transgenic mice, this will possibly provide physical and theoretical basis on miRNAs regulating coat color and even other physiological process.

毛色是毛用动物最重要的经济性状之一，其形成过程受众多基因的调控。本课题组对此进行了大量研究，但国内外至今尚未在毛色形成的miRNAs调控机制方面进行过探讨。项目以小鼠为研究对象，通过生物信息学筛选的方法选取可能影响毛色形成的miR-488，并构建其真核表达载体，采用细胞转染技术分析在细胞水平过表达miR-488对色素生成基因α-MSH的调控，转基因鼠制备技术观察在动物水平过表达miR-488对毛色形成的影响，免疫组织化学和激光共聚焦技术检测miR-488对转基因鼠皮肤黑色素细胞发育的影响，结合western-bolt、qPCR等技术从蛋白和基因水平揭示其对色素生成路径α-MSH/MC1R及毛色形成机制的调控作用。通过本研究将获得毛色改良的C57BL/6小鼠，揭示miR-488对色素生成以及毛色形成机制的调控作用，建立一套研究miRNAs在毛色形成过程中的调控作用模型。

毛色是毛用动物重要经济性状之一，其形成过程受众多基因的调控。项目以小鼠为研究对象，证明了miR-488在毛色形成过程中，通过调节毛色相关基因α-MSH前体POMC的表达起重要的调控作用，还研究了miR-488调节毛色形成过程中的潜在靶点EDN3、SLC45A2、OA1和MC1R等基因与毛色形成的相关性。本项目以免疫组织化学、免疫印迹、实时荧光定量PCR、western blot、转基因等技术，深入分析了miR-488与POMC的靶向关系，以及EDN3、SLC45A2、OA1和MC1R分别对小鼠、绵羊和羊驼毛色的调控作用，为研究miRNAs在毛色形成过程中的调控作用提供了理论基础。本实验研究结果如下：. 1、在蛋白质和基因水平，POMC在不同毛色小鼠、羊和羊驼皮肤中的表达存在差异，各物种均为黑色表达量最高。且表达部位均位于毛球部和毛根鞘的角质形成细胞中。. 2、成功构建了miR-488的角化细胞表达载体，研究了miR-488与α-MSH前体POMC呈负调控关系。. 3、制备了miR-488过表达鼠，并表明其被毛中色素含量降低。证明了miR-488通过调控α-MSH前体POMC的表达，继而调控黑色素细胞色素生成相关基因（MITF、TYR、TYRP1、TYRP2）的表达。. 4、蛋白质和基因水平，研究了不同毛色小鼠、绵羊之间EDN3的表达，结果表明灰色小鼠EDN3表达最高、纯白绵羊EDN3表达最高。主要表达部位为毛基质、内外毛根鞘等处，不同毛色阳性着色不一。. 5、研究了不同毛色小鼠和绵羊之间SLC45A2的表达与定位。结果显示SLC45A2在棕色小鼠和纯黑绵羊中表达高于其他毛色。其在小鼠和绵羊毛基质、毛乳头、内外根鞘等部位均呈现出不同程度的棕黄色阳性表达。同时SLC45A2还介导小鼠黑色素细胞色素生成。. 6、发现不同毛色小鼠之间OA1的表达有显著差异，其中棕色小鼠皮肤表达最高。免疫荧光定位发现，OA1存在于内、外根鞘，毛母质和真皮乳头。过量表达OA1对毛色相关基因（MITF、TYR、TRP1、TRP2、PMEL、GPNMB）存在影响。. 7、研究发现不同毛色绵羊之间MC1R的表达差异极显著，纯黑绵羊MC1R表达极高。免疫组化结果显示，其主要表达部位为毛囊的基质、根鞘等区域，但不同毛色表达不一。