拟南芥Bestrophin基因调控种子粘液质果胶结构的分子机制研究

Pectins are heterogeneous polysaccharides of the plant cell walls, which are mainly found in primary cell walls and middle lamellae. Pectins play essential roles in plant growth, development, morphogenesis, cell-cell adhesion and defense responses etc. Pectin is the most structurally complex family of poly-saccharides in nature, which makes it challenging to determine and investigate their biosynthesis, modification, and organization in the plant cell wall. During differentiation of Arabidopsis thaliana seed coat epidermal cells, dramatic changes occur highlighted by the synthesis and secretion of large amounts of pectinaceous mucilage. This cell type, therefore, provides an excellent molecular-genetic model to study the biosynthesis, secretion and modification of pectin. By laser capture microdissection of Arabidopsis seed epidermis cells combined with microarray analysis, we identified a T-DNA insertional mutant, which was caused by the disruption of a Cl- channel protein bestrophin. The mutant displayed severe mucilage defects, and smaller molecular mass, structural changes in RG I, in addition to Ca2+ concerntration alteration. This study aims to carry out a detailed functional analysis of bestrophin genes in Arabidopsis. We will emphasize to elucidate the molecular mechanism underlying the structural modification of mucilage by the interactive actions between bestrophin and Ca2+. In addition, microarray analysis will be performed to reveal the regulation network in pectin structure modification. The results obtained will provide new experimental evidences for the functional roles of ion channel proteins in pectin structure modification.

果胶质是植物细胞壁的主要成分之一，主要存在于初生细胞壁和胞间层，在植物生长发育、形态建成和防御反应等过程中都发挥着重要作用。由于果胶质的组成和结构的复杂性，目前对其生物合成和修饰方面的研究还不够深入。在拟南芥种子发育过程中，种皮细胞会合成和分泌大量的粘液质多糖，其主要成分是果胶质。种子粘液质为研究果胶质的合成、分泌及其结构修饰提供了一个理想的模式体系。我们前期借助对拟南芥种子表皮细胞的激光捕获显微切割并结合基因芯片分析，筛选得到一个种子粘液质果胶缺陷型突变体，其种子粘液质容易脱落，果胶质分子量变小，RG I的结构改变，Ca2+浓度降低，该表型是由氯离子通道蛋白Bestrophin的插入缺失导致。本研究拟针对拟南芥Bestrophin基因的功能展开深入解析，探讨bestrophin与Ca2+互作影响果胶质结构的分子机制，并通过基因芯片解析bestrophin参与果胶质结构修饰的调控网络。

拟南芥种皮粘液质已成为研究果胶质多糖合成、调控以及细胞壁不同组分间相互作用的一个理想的模式体系。本研究以拟南芥种皮粘液质为研究体系，研究了氯离子通道蛋白Bestrophin (BEST) 参与粘液质果胶多糖结构修饰的分子机制。BEST1基因的T-DNA插入突变体best1表现出粘液质缺陷，运用生化和免疫检测的方法检测了种子粘液质结构和组成，发现 best1 种子粘液质总量变化不明显，但外层粘液质含量显著提高而内层粘液质含量降低，说明粘液质从内层转移至外层，而外层粘液质大分子多糖的分子量发生改变。ELISA结果表明best1粘液质的结构发生了明显的变化，低甲酯化HG含量升高，甲酯化程度降低，鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RG-I)侧链增多，木葡聚糖和木聚糖含量增加，电感耦合等离子质谱(ICP-MS)测定结果表明best1种子粘液质中钙离子含量高于野生型，而利用非损伤微测技术和Fluo3-AM 活体染色也表明best1表皮细胞内含有更多的钙离子。据此推断best1形成的HG-Ca2+蛋箱结构可能发生改变，从而影响粘液质的结构。此外，best1种子粘液质中结晶化纤维素含量下降，也可能会导致内层粘液质结合较松散而易脱落。据此，本研究首次揭示了BEST1通过影响HG-Ca2+交联结构和结晶化纤维素的含量，在种皮粘液质的结构维持中发挥重要作用。. 此外，利用基因芯片数据，根据基因共表达趋势分析，鉴定出两个与BEST1共表达的糖基转移酶基因（GT43家族的IRX14和GT47家族的IRX7），并对其功能进行了详细分析，发现两个基因的T-DNA插入突变体的粘液质表型出现缺陷，跟best1表型类似。通过一系列的生化和化学分析表明，IRX14参与了粘液质中半纤维素成分木聚糖主链的合成，而IRX7参与了粘液质中木聚糖非还原末端四糖序列的合成。此外，两个突变体中结晶化纤维素含量显著降低。这些结果首次揭示了IRX7和IRX14共同参与粘液质中木聚糖的生物合成，并间接影响到了粘液质中结晶化纤维素的含量，半纤维素成分木聚糖与结晶化纤维素一起共同维持了粘液质的结构和形态。. 在本项目资助下，在Plant Physiol和J Exp Bot等期刊发表了4篇SCI论文，培养了3名中青年科研骨干，3名博士研究生和1名硕士研究生。