核仁蛋白PAK1IP1调节核糖体生物合成的功能及机理研究

PAK1IP1是一个进化上非常保守的核仁蛋白，含有多个WD40结构域。敲除酵母中的同源基因导致细胞死亡，而哺乳动物中的PAK1IP1基因能修复致死表型。申请者已发表的论文发现PAK1IP1与MDM2结合抑制p53的泛素化降解，影响细胞G1/S期转换而抑制细胞增殖。干扰内源PAK1IP1的表达促使游离核糖体蛋白的释放而稳定p53蛋白，出现与过表达类似的表型。为进一步深入研究，本申请将结合细胞、动物模型和分子机理的研究，阐明其生物学功能。拟利用northern杂交和氚标记rRNA等技术，明确PAK1IP1在核糖体加工过程中的功能；拟利用串联亲和纯化技术发现其相互作用蛋白，根据发现的蛋白复合物，进一步阐明其相关功能和作用机制；利用ES细胞分化模型，研究其调控干细胞生长和分化的功能及机理；利用基因敲除小鼠模型研究其在胚胎发育和肿瘤发生发展中的功能。

PAK1IP1是核仁蛋白，含有多个WD40结构域。敲除酵母中的同源基因导致细胞死亡，而哺乳动物中的PAK1IP1基因能修复致死表型，说明该基因是一个进化上非常保守具有重要功能的蛋白。我们的前期研究表明PAK1IP1参与核糖体应激过程，调节P53的稳定性。本课题发现PAK1IP1在核糖体RNA加工中调节32S向28S rRNA的加工进程而调控60S核糖体大亚基的成熟。通过串联亲和纯化技术鉴定了多个潜在与PAK1IP1相互作用的蛋白，通过验证发现Nucleostemin与PAK1IP1相互作用。进一步的研究发现PAK1IP1可能通过影响Nucleostemin在核仁中的滞留而调控核糖体RNA的加工过程。通过TALEN基因编辑技术构建了PAK1IP1基因敲除小鼠模型，发现基因缺失小鼠在着床前胚胎致死。除了TALEN基因编辑技术，还开展了基于CRISPR/Cas技术体系的小鼠和大鼠胚胎基因操作研究。利用CRISPR技术，通过注射两个sgRNA构建了基因组DNA片段的删除的小鼠品系，并在大鼠胚胎中通过注射针对不同基因的sgRNA，得到多基因同时突变的大鼠品系，成为世界上第一个报道利用CRISPR/Cas9技术构建基因修饰大鼠的技术团队。