香烟烟雾刺激下UCHL1通过调控β-catenin-EMT信号通路促进 COPD小气道重构的机制研究

The remodeling of small airway induced by cigarette smoke is one of the main pathogenesis of COPD, but the specific mechanism is unclear. Our preliminary results showed that alveolar epithelial cells could appear oxidative stress stimulated by the cigarette smoke. Meanwhile, epithelial-mesenchymal transition (EMT) was observed in the alveolar epithelial cells, and further proteomics analysis showed that the UCHL1 gene might have certain effect on the process. So, we speculate that UCHL1 activate the Wnt/β-catenin-EMT signal pathway under the oxidative stress. The occurrence of EMT in the epithelial cells lead to the remodeling of the small airway. In our study, we aim to analyze the correlation between UCHL1 expression and EMT in the airway epithelial cells and small airway remodeling by retrospective clinical study under the oxidative stress state related to smoking. Taking the Wnt/β-catenin-EMT signaling pathway as the breakthrough point, we will demonstrate the specific mechanisms from the level of cell and animal models. There is no report published before about the regulation of UCHL1 on EMT and small airway remodeling in patients with COPD. Our research would clarify the biological functions of UCHL1 and establish the regulatory role of UCHL1 on EMT and small airway remodeling, providing some potential targets in intervention and treatments for patients with COPD.

香烟烟雾导致小气道重构是慢阻肺的主要发病机制之一，具体机制尚不明确。我们前期发现烟雾刺激下肺泡上皮细胞出现氧化应激，并观察到肺泡上皮细胞出现上皮间质转化（EMT），进一步蛋白组学显示泛素羧基末端水解酶 L1（UCHL1）基因可能有一定的作用，因此我们推测UCHL1在氧化应激下激活Wnt/β-catenin通路，使气道上皮细胞出现EMT，导致小气道发生重构。本研究拟临床回顾性研究阐明吸烟相关的氧化应激状态下，UCHL1与气道上皮细胞EMT以及小气道重构之间的相关性，并以Wnt/β-catenin-EMT信号通路为切入点，从细胞以及动物模型水平深入论证其具体作用机制。由于UCHL1调节EMT、影响慢阻肺患者小气道重构的研究均未见报道，因此本研究具有源头创新性，将有助于阐明UCHL1的生物学特征、UCHL1影响EMT及小气道重构的作用及分子机制，并为慢阻肺的防治提供新线索和潜在的干预靶标。

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是全球第三大主要死亡原因，香烟烟雾是诱导COPD的重要影响因素之一，但其中具体影响机制仍未明确。我们同时建立了长期烟雾暴露小鼠模型和香烟烟雾提取物（CSE）长期处理的细胞模型。首先通过免疫组化技术检测小鼠肺组织的蛋白表达，结果发现，与对照组相比，长期烟雾暴露组的抗氧化蛋白（TRX、SOD1、GPX1）表达水平下降，提示氧化应激的发生；EMT相关蛋白发生改变（上皮标志E-cadherin的表达下降，间质标志ɑ-SMA的表达上升）；UCHL1蛋白表达增加，明确了香烟烟雾对UCHL1蛋白表达的促进作用。利用western blot技术同样明确了，长期CSE处理会诱导UCHL1表达；抑制抗氧化蛋白表达；促进EMT相关蛋白改变（上皮标志E-cadherin的表达下降，间质标志 ɑ-SMA的表达上升）。我们对细胞进行了体外功能实验，相关试剂盒检测氧化应激相关指标（ROS水平、总GPX、SOD水平），结果提示长期CSE处理会诱导BEAS-2B细胞发生氧化应激；划痕实验也明确了长期CSE处理会诱导BEAS-2B细胞出现上皮间质转化（EMT）。我们进一步构建了UCHL1过表达、UCHL1抑制慢病毒载体、空载体，包装成高滴度慢病毒，分别将其转染进BEAS-2B细胞中。通过Transwell实验、MTT检测发现，UCHL1过表达轻微促进了BEAS-2B细胞的EMT和增殖；而抑制UCHL1则明显抑制细胞迁移与增殖；相关试剂盒检测氧化应激指标（ROS水平、总GPX、SOD水平），结果提示UCHL1过表达逆转了香烟烟雾诱导的细胞氧化应激水平、而当UCHL1抑制时氧化应激进一步加剧；通过western blot检测检测结果提示，UCHL1过表达可促进抗氧化蛋白GPX1蛋白的表达但难以逆转CSE对GPX1的强大抑制作用，抑制UCHL1可明显降低GPX1的表达，加剧CSE的对GPX1的抑制；UCHL1过表达可以促进E-cadherin的上升，降低ɑ-SMA的表达，并且逆转CSE对EMT的诱导；UCHL1抑制则明显加剧了CSE对EMT的诱导效应。鉴于UCHL1对氧化应激、EMT等COPD发生发展的重要环节的抑制作用，UCHL1或许具有成为COPD诊断分子标志物和治疗靶点的潜力。