基于微流控温度梯度毛细管电泳的基因突变及甲基化联合检测系统的建立

基因突变和DNA甲基化是肿瘤早期诊断和筛查的重要分子标志物。最新研究表明，不同肿瘤个体中基因突变和甲基化存在广泛异质性，因此，两者的联合检测可有效提高肿瘤的阳性检出率。但目前常规的基因突变或甲基化检测方法存在样品需要量大，操作繁琐，耗时过长，费用高等问题，同时也不适合两者的联合检测。为此，本研究提出利用微流控芯片技术样品消耗少，分析速度快，费用低的优势实现高效检测。同时利用亚硫酸氢盐将靶序列中CpG位点甲基化状态差异转化成核苷酸点突变，将申请者前期创建的可检测基因突变的微流控温度梯度毛细管电泳系统（TGCE）用于甲基化检测，并通过集成阵列通道，创建能同时检测多基因突变及甲基化的阵列式TGCE微流控技术平台，以大肠癌患者的粪便脱落细胞为材料，以4个大肠癌较常发生的K-ras、p53基因突变及p16、hMLH1基因启动子甲基化作为检测对象，为高效进行肿瘤的无创性诊断和筛查提供新的方法。

肿瘤的发生是分子上逐步累积的多基因改变的过程，通过基因的筛查可以对肿瘤进行有效的诊断、治疗及预测。单核苷酸构象多态性/基因突变和DNA甲基化是最常见的遗传学和表观遗传学改变形式，经常用作研究肿瘤的重要分子标志物，特别是随着近年来与之相关的肿瘤靶向治疗的飞速发展，基因突变和DNA甲基化的准确检测将为临床肿瘤治疗带来重要的变革。但目前常规的基因突变或甲基化检测方法存在灵敏度低、样品需要量大，操作繁琐，耗时过长，费用高等问题。为此，本研究提出利用微流控芯片技术灵敏度高、样品消耗少，分析速度快，费用低的优势实现对基因突变和DNA甲基化的高效检测。我们首先将前期创建的可检测基因突变的微流控温度梯度毛细管电泳系统(TGCE)用于结直肠癌细胞株和结直肠患者肿瘤组织、石蜡标本和粪便脱落细胞中KRAS基因的突变检测。单次检测在6分钟内即可完成，样品消耗仅为纳升级，检测灵敏度度可达0.2%。对98例石蜡切片KRAS基因突变检测结果显示，微流控TGCE法检出率为47.9%，显著高于PCR产物直接测序的检出率(23.5%)，且直肠癌中K-ras 基因突变率明显高于结肠癌。对30例大肠癌肿瘤组织和配对粪便样品进行微流控芯片检测的结果显示，KRAS基因突变的检出率为57%和53%，粪便样品与肿瘤组织中KRAS基因突变的符合率为99%，均明显高于PCR产物直接测序。以上与直接测序结果不同的样品均经克隆测序得到验证。为实现微流控TGCE平台对DNA甲基化的检测，我们利用亚硫酸氢盐将靶序列中CpG位点甲基化状态差异转化成核苷酸多点突变，建立了一种结合亚硫酸氢盐的微流控芯片TGCE检测基因启动子甲基化的方法，即亚硫酸氢盐-微流控TGCE法。分别在5℃和10℃温度梯度下完成了具有不同数量和不同位点的p16基因甲基化模式样品及复杂甲基化样品的检测，进而检测了7种大肠癌细胞系和20例大肠癌患者肿瘤组织的p16基因甲基化，灵敏对为0.1%，并尝试了多种基因甲基化(p16和hMLH)在相同温度梯度下的同时检测。为提高检测通量，我们设计制作了阵列式及连续进样式微流控芯片并建立起了相应的检测装置，实现了多样品的联合、顺序检测。综上，该研究显示该微流控TGCE平台能够快速、灵敏和低耗地检测实际临床样品中低丰度的基因突变和甲基化，有助于为临床提供患者的基因信息以进行大肠癌的早期诊断和指导患者的个性化治疗。