双谱估计及其应用的研究

参照国外报道设计并合成了一对引物，从我国感染GLRaV的葡萄韧皮部中提取到约18kb的GLRaBV-dsRNA，以此为模板，采用RT-PCR扩增约1kb的cDNA片段。PCR产物被克隆到pBluescript ⅡSK中间载体，转化大肠杆菌E.coliJM109菌株，经酶切分析，得到了正向插入的重组质粒。测序发现，GLRaV-CP基因与美国报道的GLRaV-3CP基因核苷酸序列同源性达99.15%，推测氨基酸序列同源性98.09%。通过大肠杆菌表达载体pBV221，构建了GLRaV-CP基因的大肠杆菌蛋白表达克隆，发现一条约35KDa的特异表达蛋白带，与GLRaV-3外壳蛋白大小一致。通过载体pBin438，构建了GLRaV-CP基因的植物表达载体，实现了以农杆菌介导的葡萄遗传变化，获得了抗卡那霉素和PCR检测阳性结果的转基因葡萄再生植株。