猪瘟病毒非结构蛋白介导基因组复制和病毒粒子装配调节与致病性研究

在揭示猪瘟病毒非结构蛋白NS3和NS5B酶学特性及基因组3′端非编码区与病毒毒力关系基础上，采用结构功能预测和构建突变体策略，体外研究NS2-3、NS3和NS5B等病毒复制装配调控相关蛋白的结构与功能；进而在CSFV全长感染性cDNA克隆上进行遗传操作，构建、拯救一组具有不同NS2-3切割效率及NS3和NS5B酶活性的病毒突变体，研究这些病毒突变体的复制装配效率、增殖特性和在猪体的致病性，揭示NS2-3、NS3和NS5B等非结构蛋白在CSFV复制装配中的作用及其调节机制；发现CSFV增殖效率低下的分子基础；探讨CSFV复制装配调节与致病性的关系，进而加深对猪瘟发病机理的理解，并为基于感染性cDNA克隆操作构建高效抗猪瘟基因工程疫苗提供技术支撑。

采用杆状病毒表达了野生型和位于NS2跨膜区的7个位点氨基酸突变体NS23pro，分析了这些氨基酸在NS23自切割中的作用；采用感染性cDNA克隆反向遗传操作在基因组上对NS2中7个位点进行突变，体外转录vRNA转染PK15细胞拯救CSFV，并进行特性研究。结果显示，NS2蛋白第37、52、57、60、78、85和100等位点单个氨基酸突变可某种程度降低NS23的自切割活性；第60位的Asp、第78位的非Lys对于感染性CSFV产生起关键作用，这两种致死突变不取决于NS23的自切割活性高低；与野生型相比，突变体NS2在细胞中的分布及与E2的相互作用表现差异。用CSFV弱毒疫苗C株3′UTR、E2单独或同时替换强毒Shimen株对应区域构建了3种嵌合病毒，研究显示，3′UTR单替换对嵌合病毒特性没有显著影响；E2单替换导致产生感染性病毒和形成蚀斑能力一定程度下降，但在细胞传代后恢复；而E2和3′UTR双替换嵌合病毒生长特性和形成蚀斑能力显著降低，在细胞传代过程中保持稳定。这些工作加深了对CSFV复制调控和致病机制的理解，为发展猪瘟防控新策略提供新的思路。