脑组织微区金属代谢模式的组学研究及在阿尔茨海默氏疾病过程中的意义

本课题将建立基于同步辐射X射线荧光(SRXRF)的元素标记免疫组化方法用于蛋白的检测，发展SRXRF用于蛋白质成像和蛋白质检测的新的方法学。应用同步辐射的微束X射线荧光和同位素稀释-LA-ICP MS的元素和蛋白质的原位分析技术，用AD动物模型，通过定性、定量研究元素（Cu、Zn、Fe、Mn、P、S等）和生物标志物蛋白（A-beta蛋白和Tau蛋白）在AD病发生、发展过程中在特定脑组织区域中的空间局域分布，包括金属聚集、氧化胁迫、A-beta蛋白斑块和蛋白质磷酸化发生的地点及程度，揭示金属元素聚集、代谢模式与AD病发生、发展过程的相关性，为疾病的诊断和治疗提供依据。

本课题应用和发展了SR-XRF对生物组织金属和蛋白质定量成像方法，揭示了金属元素聚集、代谢模式与AD病发生、发展过程的相关性，为疾病的诊断和治疗提供了直接的依据。. 首先，利用基体相似的标准参考物进行康普顿散射与单位浓度元素荧光强度比值Ric的校正，建立了SR-XRF金属元素定量方法，得到组织中金属元素定量分布元素图像。利用上述定量方法，分析了AD 转基因鼠脑切片中金属Cu, Fe, Zn 和Ca随AD疾病发展过程中在脑组织中的分布、代谢和聚集特征。研究发现，随年龄和AD疾病的发展，AD鼠脑中可以呈现明显的脑特定敏感区域金属元素聚集趋势。金属元素Ca、Fe、Cu、Zn等的含量随年龄增长不断增加，但AD鼠的增加程度高于对照鼠，且元素富集区域有所差异。对照鼠中Cu含量在海马CA3及丘脑区增加明显，而AD鼠则主要在海马及皮层区域；AD鼠Fe含量在黑质和胼胝体等区域明显升高，而对照鼠在黑质和皮层等脑区升高明显；AD模型鼠Zn含量的升高主要在中脑、丘脑等脑区，而对照鼠则主要在大脑皮层，上述实验结果表明，金属的异常聚集和代谢异常与脑龄和AD病病理改变和疾病发展有关。利用同步辐射近边吸收谱（SR-XANES）研究了AD脑区中金属Fe和Cu的氧化态；研究发现在海马及皮层等Fe元素富集区域，Fe主要以高氧化态的三价存在；而在海马和中脑等Cu元素富集区域，Cu则以混合价态存在。证明了Cu在AD脑组织中氧化应激反应的主导地位。海马中低价铜的含量高于中脑，说明AD鼠脑组织海马中的氧化负载较重，为解释Cu在脑中的神经毒性及在AD病发展中的作用提供了支持。. 课题建立了基于纳米金标记免疫组化法与SR-XRF方法结合，发展了SRXRF用于蛋白质成像和蛋白质检测的新的方法。利用该方法展示了APP转基因小鼠脑中A-beta和APP蛋白与金属元素Cu和Zn随A-beta斑块沉积的动态聚集特征，说明元素Cu、Zn是一组随脑龄在脑中聚集的金属；Zn的聚集与A-beta蛋白随月龄的增加在脑中的表达量增加具有高度一致，与体外实验结果吻合，说明老龄脑金属Zn的代谢异常与AD病的发展关系密切；而金属Cu在AD低月龄鼠脑中聚集，且与早期A-beta在脑中表达高度一致，说明金属Cu有可能在早期促进A-beta蛋白聚集发生作用。