转录调节因子Rgg与环境因素对2型猪链球菌89K致病岛的交互调控研究

Streptococcus suis serotype 2 (SS2) had caused two severe outbreaks of human epidemic in China. Clinical and pathological analyses revealed the hallmarks of typical streptococcal toxic shock syndrome（STSS）, which to date had only been associated with GAS infection. By whole genome shotgun sequencing and PCR assay, a specific 89 kb DNA fragment was identified within the genome of the highly pathogenic chinese isolates, which was not found in European virulent strains and domestic avirulent isolates. It shared the universal properties of pathogenicity island (PAI) and was designated PAI89K, consistent with its pivotal role in STSS and high virulence. Further genetic evidence showing that 89K can spontaneously excise to form an extrachromosomal circular product and transfer to non-89K SS2 recipients has strengthened the case that 89K is a PAI. We previously showed that inactivation of Rgg transcriptional regulator in SS2 could influenced metabolism and virulence of SS2, also resulted in transcriptional alteration of numerous genes within 89K PAI, suggesting that the Rgg regulator might directly or indirectly participate in the virulence regulation of 89K PAI. Therefore, the aim of this study is to identify those genes directly regulated by Rgg within 89K, and assess the contribution of Rgg regulator and environmental conditions to regulation of 89K PAI, which elucidates the pathogenesis of Chinese highly invasive SS2 isolates more completely and accurately.

2型猪链球菌（SS2）曾在我国两次引发重大公共卫生事件，被感染的病猪达数万头，从业人员感染两百余例。本课题组对现场分离的强致病株进行全基因组测序和功能注释，发现两次流行的致病株均携带独特的89 kb核酸片段（命名为89K），结构符合致病岛特征，基因敲除证实89K与细菌致病力密切相关，而且89K能在自身编码的一系列酶类作用下游离、复制并转移至其它SS2菌株，证明了89K确为SS2中国强毒株通过基因水平转移获得的致病岛。我们在前期对SS2基因组编码的转录调节因子Rgg的功能研究中发现，Rgg的缺失不但影响SS2的代谢功能和毒力，而且改变了89K致病岛上大量编码基因的转录水平，提示Rgg可能直接或间接参与环境因素对89K致病岛的调控。因此，本项目拟鉴定Rgg直接调控的89K靶基因，并研究Rgg转录调节因子和细菌生长环境交互调控89K致病岛的分子机制，从而更加系统全面地阐明SS2强毒株的致病机制。

2型猪链球菌（SS2）是一种新发的人兽共患传染病病原体，1998年和2005年分别在江苏和四川发生两起SS2流行感染人和猪的公共卫生事件，临床病人出现了国内外从未报导过的链球菌中毒性休克综合征（STSS），严重威胁公共卫生安全。近年我国突发SS2大规模流行和STSS这一新临床类型的出现，提示我国高致病性SS2已经发生了毒力变异。本项目前期通过比较基因组学研究发现我国高致病性SS2含有一个独特的毒力岛89K，该毒力岛的存在很可能与STSS的发生有着密切的联系。我们研究发现SS2中国强毒株基因组中存在全局转录调控因子Rgg，经基因敲除、动物实验及基因芯片等系统研究表明，对细菌的生长代谢和致病性具有重要的调节作用。为进一步了解Rgg对SS2 致病的调控作用，我们继续通过原核表达Rgg蛋白并运用凝胶迁移阻滞实验(EMSA)和染色质免疫共沉淀实验筛选到了3个受Rgg直接调控的毒力相关基因，包括位于89K致病岛上的Tn916转录调节子（ssu0920）以及编码β-D-半乳糖苷乳糖水解酶的基因bgaC（ssu0449）等。随后我们通过THP-1巨噬细胞模型分析比较了Rgg功能缺失前后细菌在高葡萄糖培养基中生长后刺激巨噬细胞产生炎症因子的变化，发现突变株的刺激THP-1巨噬细胞产生炎性因子的水平显著降低，其功能变化与细菌培养基中的糖浓度无关。. 在本项目的支持下，我们同时还开展了以下实验研究：①通过实验证实BgaC在乳糖代谢通路中的功能，并与细菌毒力相关，在调节SS2的黏附和抵抗吞噬能力方面上发挥了重要作用；②鉴定了SS2基因组中SsuDAT1I限制修饰系统的结构与分布规律，初步探讨SsuDAT1I与SS2菌株毒力进化的关系；③对SS2细菌表面的寡肽结合蛋白OppA进行了鉴定与生物活性研究，证实OppA与SS2的营养摄取和致病力相关，且具有良好的免疫原性；④对SS2的溶血素样蛋白HLP进行了序列分析，实验证实其具有溶血功能，可能与SS2的致病性相关。. 本项目的研究结果推进了我们对SS2中Rgg调控信号通路的认识，有助于进一步揭示SS2强毒株的分子致病机理。