肝豆片干预Wilson病模型小鼠线粒体自噬的机制研究

Wilson's disease (WD) is a neurological genetic disease caused by mutations，that lead to the formation of the body's copper excretion obstacles。 Pathological study findings WD patients showed widespread reduction in the number of nerve cells called neurons or lost, and the cells and minimize copper accumulation showed a correlation. Animal studies in rats and copper load WD TX transgenic mouse model also found a similar phenomenon, and reduced from morphology to TX mouse brain neurons and mitochondrial damage performance, suggesting that excessive accumulation of copper under TX Clear exacerbate neuronal cells in mice. The latest study found that the mitochondrial autophagy start autophagy cell self-cleaning mode that copper exposure in cultured cells are active, suggesting that copper accumulation and mitochondrial autophagy correlated the clinical treatment of WD On Gandou piece achieved good effect, liver copper flakes in addition to the role of the outside row, has a protective effect on the nervous system, suggesting that the effect of previous studies may be related to mitochondrial autophagy related. The project intends to compare liver flakes incubated in cell culture observation front and rear TX DL mice and different concentrations of copper cortical neurons in mice mitochondria autophagy, as well as the detection of mitochondrial autophagy pathway different expression levels of key proteins, analysis of copper and cortical neurons correlation between mitochondrial autophagy and explore liver beans and neuroprotective mechanisms affecting piece of mitochondrial autophagy.

Wilson病（WD）是由于基因突变导致铜排泄障碍而形成机体铜蓄积一种神经遗传疾病。病理研究发现WD患者表现出神经细胞数目广泛减少或称神经细胞丢失，且细胞减少程度与铜蓄积呈相关性。在铜负荷大鼠及WD转基因模型TX小鼠的动物研究也发现类似现象，并从形态学观察到TX小鼠脑组织神经元细胞减少和线粒体损害表现，提示铜过度蓄积下TX小鼠神经元细胞清除加剧。最新研究发现线粒体自噬启动细胞自噬这一细胞自我清除方式在铜染毒培养细胞中表现异常，铜蓄积与线粒体自噬存在相关性。在WD的临床治疗上中药肝豆片取得良好疗效，肝豆片除排铜作用外，对神经系统有保护作用，前期研究提示这种作用可能与线粒体自噬有关。本项目拟通过细胞培养观察比较肝豆片孵育前后TX小鼠和不同铜浓度下DL小鼠皮质神经元线粒体自噬情况，以及通过检测线粒体自噬不同通路关键蛋白表达水平，分析铜与脑皮质神经元线粒体自噬相关性，并探讨肝豆片对线粒体自噬。

背景：肝豆状核变性（Wilson’s Disease，WD）是由于基因突变导致铜排泄障碍而形成机体铜蓄积一种神经遗传疾病。病理研究发现WD患者表现出神经细胞数目广泛减少或称神经细胞丢失，且细胞减少程度与铜蓄积呈相关性。细胞的线粒体不仅合成能量，也是感知器和执行器，可控制内源性凋亡、调节钙离子平衡以及影响基因表达。线粒体自噬可以清除病变的线粒体、也可进一步启动细胞自我清除，通过有目的选择性清除损伤的线粒体，达到保护正常细胞功能。在WD的临床治疗上中药肝豆片取得良好疗效，对神经系统有保护作用，前期研究提示这种作用可能与线粒体自噬有关。本项目拟通过细胞培养观察比较肝豆片孵育前后TX小鼠和不同铜浓度下DL小鼠皮质神经元线粒体自 噬情况，以及通过检测线粒体自噬不同通路关键蛋白表达水平，分析铜与神经细胞线粒体自噬的影响。主要研究内容：建立铜负荷肝豆状核变性小鼠海马神经元细胞模型，观察不同剂量肝豆片血清孵育下神经元细胞和线粒体形态，检测细胞活力指标，通过检测神经神经元细胞中PinK1 、Parkin、LC3、Binp3等线粒体自噬通路相关蛋白在转录和翻译水平的表达。同时提取线粒体检测神经元细胞线粒体铜含量的改变。结合细胞模型及各对照组的形态学观察和相关蛋白检测，初步探讨肝豆片对神经细胞线粒体自噬通路的影响机制。重要成果和关键数据：观察到铜负荷细胞超微结构改变，出现线粒体损伤，并有自噬体形成。铜负荷细胞线粒体铜、锌含量显著升高。实验发现肝豆片可能通过上调Pink1、Binp3，下调Parkin、LC3干预Pink1/Parkin自噬通路，调控主动自噬，从而达到细胞保护作用。本研究价值和科学意义：研究证实WD患者存在线粒体损害，可能为WD临床进行线粒体保护治疗提出新的思路。肝豆片可能通过调控线粒体自噬而保护神经细胞，而线粒体自噬与帕金森病、运动神经元病、阿尔兹海默病等神经变性疾病相关，也与肿瘤、糖尿病等疾病关系密切，如能进一步明确肝豆片的有效成分和干预机制，将可能拓展中医药在该类疾病的临床应用。