VIPP1蛋白运动的调控及其修复叶绿体被膜的分子机理研究

Rupture of chloroplast envelope membranes have been demonstrated under different stress conditions, but the process of membrane resealing is still not clear. Our study demonstrated that VIPP1 is critically important for the chloroplast envelope maintenance. VIPP1 overexertion in Arabidopsis could enhance tolerance against heat stress. VIPP1-GFP started moving when the chloroplast was under hypotonic stress with water, which implied that VIPP1 dynamics is related to its role of membrane repair. Recently, we found that Ca2+ could inhibit the VIPP1 movement in chloroplast, and the dynamics could be re-activated by GTP. Besides, VIPP1 also could bind with phosphatidic acid (PA) that is known to play roles in both vesicle fission and fusion. In this study, we will further study the regulation of VIPP1 dynamics by Ca2+ and GTP, testing possible interactions between them and GTPase activity of VIPP1. One the base of PA binding, the vesicle formation and fusion regulated by VIPP1 will be explored. And then, effect of Ca2+ and GTP on interaction between PA and VIPP1, and vesicle formation and fusion will be studied. On the base of above experiments, the relationships among these factors will be figured out, and mechanism of chloroplast envelope membrane resealing will be clarified.

逆境条件下植物叶绿体被膜的完整性常常遭到破坏，目前其修复过程仍然不清楚。研究显示：VIPP1对叶绿体被膜的修复至关重要。过表达VIPP1可以增强拟南芥对高温的抗性。当叶绿体处于低渗胁迫时，VIPP1-GFP 蛋白开始在叶绿体内移动，表明VIPP1运动与叶绿体被膜的修复有关。最近我们研究发现Ca2+可以抑制VIPP1运动，而这种抑制作用可以被GTP逆转。此外，我们还发现VIPP1可以与磷脂酸（PA）特异结合，而PA与囊泡的形成和融合相关。在本研究中，我们将深入研究Ca2+和GTP调控VIPP1运动的机制，以及可能的相互作用和VIPP1的GTPase 活性。在VIPP1和PA相互作用的基础上，研究VIPP1在叶绿体内囊泡形成和融合的作用，明确Ca2+和GTP对这一过程的影响。在上述研究的基础上，阐明这些可能的修复因子之间的关系及由此构建的叶绿体被膜修复网络。

质体囊泡诱导蛋白（VESICLE-INDUCING PROTEIN IN PLASTID1，VIPP1）在光合放氧生物中是一个保守蛋白，是从细菌中PspA蛋白进化而来的。尽管有关VIPP1蛋白的功能已经有多种推测，包括类囊体的形成、叶绿体被膜完整性维持、膜融合以及光合作用的调控，但是其在叶绿体膜完整性的精确调控机制仍然不清楚。我们前期的研究显示拟南芥VIPP1蛋白在低渗胁迫和热胁迫下表现出复合体解聚的特性。对于VIPP1蛋白运动特性的研究会有助于我们深入阐明其修复叶绿体被膜的分子机制。从拟南芥VIPP1-GFP/Col转基因株系分离叶绿体，然后在荧光显微镜下研究GTP和Ca2+作用下VPP1-GFP蛋白复合体的运动规律。实验结果表明，离体叶绿体在低渗胁迫下膨胀变大，被膜与类囊体间隙变大并鼓起，VPP1-GFP蛋白复合体开始自由移动。CaCl2可以完全抑制VPP1-GFP蛋白的运动，这种抑制作用是Ca2+而不是Cl-引起的。GTP可以有效逆转Ca2+对VPP1-GFP蛋白运动的抑制作用，再次激活该蛋白的运动。低渗胁迫下，叶绿体被膜完整性的维持依赖于VIPP1蛋白的运动。综上所述，拟南芥叶绿体VIPP1蛋白的运动受GTP和Ca2+共同调控，GTP对VIPP1蛋白运动起促进作用，Ca2+对该过程起抑制作用。这些结果表明VIPP1蛋白介导了叶绿体膜的融合/重构。细胞内调控膜融合/重构的蛋白一般都需要与GTP结合或者GTP的水解，所以我们思考是否VIPP1蛋白也具有类似的特性。我们通过在大肠杆菌中表达VIPP1-His蛋白进行体外实验。VIPP1-His蛋白显示出了GTP水解的活性，并且依赖与GTP结合。尽管VIPP1蛋白不包含典型的G蛋白结构域，但是发现其氨基末端的α-螺旋对于与GTP的结合和水解以及寡聚物的形成都很重要。此外，VIPP1可以与磷脂酸（PA）特异结合，而PA与囊泡的形成和融合相关。所以，VIPP1可以携带PA分子进行叶绿体被膜的修复，GTP是这一过程能量的提供者，但是Ca2+作为一种信号分子参与了整个过程的调控。