蚂蟥冬眠机理及生理特性的研究

Whitmania pigra Whitman (Haemopidae) is the dominant resource of Chinese medicinal material Hirudo, and is the main raw material for several Chinese medicines used for cardiovascular and cerebrovascular diseases. Its artificial large-scale cultivation is urgent because of the outstanding imbalance between supply and demand. However, W. pigra hibernation restricts markedly its production efficiency and economic benefit. To date, the systematic researches on energy metabolism and physiological function in digestive tract remain poorly understood. Based on our previous work, the present project aim to clarify the degradation mechanism of structure and function through methods of several subjects such as experimental ecology, histology, morphology, chemoimmunology, molecular biology, and biochemistry. Meanwhile, the differential protein occurred in dynamic process of hibernation will be identified, predicted functionality, classified, and verify in molecular level. The ultimate objective of the present project is to explore the internal mechanism of W. pigra hibernation. This project will provide scientific basis for physiological metabolism and hibernation regulation, and for W. pigra artificial cultivation and wintering management.

蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）为药材水蛭的主要基原动物，是众多心脑血管中成药的主要原料。因供需矛盾激增，亟需开展蚂蟥规模化养殖，但蚂蟥的"冬眠"习性显著影响其养殖的生产效率和经济效益。目前有关蚂蟥冬眠机理的研究鲜见报道。本项目在前期工作基础上，拟通过实验生态学、组织结构学、免疫化学、生物化学、分子生物学、蛋白质组学等学科的方法，对蚂蟥冬眠期间消化道结构和功能、能量代谢进行研究，阐明蚂蟥休眠过程中消化道结构和功能退化的机理以及能量代谢的途径，同时筛选低温诱导蚂蟥冬眠过程中消化道关键差异蛋白，完成其功能鉴定、分析和归类，并进行分子水平表达验证，从组织、细胞、亚细胞、蛋白质水平揭示低温诱导蚂蟥休眠的内在机理，为蚂蟥生理代谢及冬眠的调控提供基础研究资料，同时可为蚂蟥人工养殖和越冬管理提供科学依据。

蚂蟥的“冬眠”习性极大程度影响其养殖效率和经济效益。本课题组经过四年的研究，已基本按照计划完成规定的内容，取得以下主要研究成果：（1）对不同温度下蚂蟥生物学特征、耗氧指标以及消化酶活性进行研究，确定4℃为成龄蚂蟥冬眠的临界温度，头部和尾部弯曲呈“弯月”状可作为其冬眠状态的标志；直接复温或以2℃•d-1速度梯度复温到20℃都可应用于蚂蟥人工出冬眠，复温72 h后投喂能减少蚂蟥出眠时死亡。蚂蟥冬眠期间消化道结构松散，黏膜层褶皱稀疏。（2）蚂蟥冬眠过程中，体重逐渐降低，在冬眠60天时达到显著性差异。体成分中脂肪、总糖和灰分含量呈降低趋势，其中总糖、灰分含量在冬眠三个时期皆有显著差异，而脂肪含量仅在冬眠60天时显著降低，蛋白质含量变化不显著。蚂蟥在冬眠过程中摄食能和排粪能为零，生长能积累为负值，所消耗的能量主要用于呼吸耗能（约84%）和排泄耗能（约16%）。（3）蚂蟥在冬眠过程中会通过调整机体组织物质代谢酶基因的表达来调控能量物质的利用，冬眠初期主要以肌肉中糖类物质提供能量，冬眠30天时上调表达肌肉和消化道脂肪代谢酶基因以动员两组织脂肪分解供能，冬眠60天后通过显著上调氨基酸分解关键酶基因表达启动蛋白质供能，而之后各代谢酶基因表达下调则是冬眠动物对低温缺食环境进一步适应的结果。(4) 运用TMT和LC MS/MS技术定性检测到蚂蟥冬眠三个期（活跃期、深冬眠期和苏醒初期）3580个蛋白，定量检测到2184个蛋白，其中390个有显著差异；定性检测2596个蛋白上有3474 个磷酸化位点，其中定量检测到1388个蛋白上有2598个磷酸化位点。通过生物信息学分析，蚂蟥在冬眠期间可能通过减弱跨膜运输和蛋白合成降低能量需求，增加细胞骨架蛋白重组细胞骨架维持细胞结构稳定来保护肠道细胞，并通过可逆蛋白磷酸化变化调控生理活动来适应冬眠不同阶段的环境。本课题研究结果初步阐明了蚂蟥冬眠期间能量代谢和自我保护的适应机制，同时可为蚂蟥室内养殖提供指导。