定向进化调控Baeyer-Villiger单加氧酶TmCHMO的区域选择性及机制解析

Baeyer-Villiger (BV) monooxygenase is a potential biocatalyst, which often efficiently catalyzes the oxidation of ketones to the corresponding esters or lactones under benign conditions. For asymmetric ketones, two possible products, normal product and abnormal product (Anti-Baeyer-Villiger product), would be generated due to the different positions inserted by oxygen atom. Only normal products are formed in the conversions of the asymmetric linear ketones catalyzed by most BV monooxygenases. The controlling mechanism of regioselectivity toward this type of ketones wasn’t explored previously, therefore, it is still a challenge to invert the regioselectivity, which limits the application of BV monooxygenases in organic synthesis. Herein, we choose the thermostable cyclohexanone monooxygenase (TmCHMO) as a model to explore the relationship between the residues lining the binding pocket and the substrates’ regioslectivity，identifying the “hot spots” of TmCHMO; Reversing the regioselectivity of TmCHMO towards octan-2-one by directed evolution based designed degenerate code and landscape; Creating the model of the interaction between the best mutant and octan-2-one, then revealing the controlling mechanism of the regioselectivity.

Baeyer-Villiger（BV）单加氧酶是一类非常有应用潜力的生物催化剂，在环境友好的条件下，能够有效催化酮底物的单加氧反应，生成相应的酯或内酯。当其转化不对称的酮底物时，由于氧原子插入位置的不同，理论上会产生两种不同的产物：正常的BV产物和非正常的反式BV产物。对于不对称的链状酮底物，绝大多数BV单加氧酶只催化生成正常的BV产物。目前,BV单加氧酶对这类底物的区域选择性控制机制尚未解析，完全反转其区域选择性仍然面临挑战，极大限制了BV单加氧酶在有机合成中的应用。本课题以一种热稳定的环己酮单加氧酶（TmCHMO）为研究对象，探索其活性中心功能位点与区域选择性之间的关系，识别调控区域选择性的“热点”位点和“热点”突变；在此基础上设计简并的密码子和有效的进化路径，定向进化反转对链式酮底物2-辛酮的区域选择性，从而实现反式BV产物的有效合成并揭示其区域选择性的控制机制。

在有机化学中，无论是合成催化剂还是贝耶尔维立格单加氧酶，操控贝耶尔维立格单加氧反应的区域选择性都面临挑战。这里，我们选取了三个链式酮底物作为研究对象，这三个酮底物在贝耶尔维立格单加氧反应中不倾向生成反式产物。通过定向进化的方法，我们反转了贝耶尔维立格单加氧酶对这三个底物的区域选择性，使其反应产物由正式反转为反式，从而解决了操控贝耶尔维立格单加氧反应区域选择性的问题。通过对热稳定的贝耶尔维立格单加氧酶TmCHMO的活性中心位点进行迭代饱和突变，该酶的区域选择性有野生型的99:1（偏好正式产物）反转为2:98（偏好反式产物）。类似的方法也成功反转了该酶对其他两个链式酮底物的区域选择性。动力学参数和熔融温度测定结果表明大多数突变体维持了催化活性和热稳定性。随后，我们构建了最优突变体LGY3-D-E的进化路径图，共包含24条进化路径。我们发现中间过渡态中间体的的绝对构型会根据进化阶段从R构型切换到S构型。量子化学聚类分析揭示了这一现象的物理基础。我们认为，瞬时性手性过渡态中间体在其他类型酶机制中的作用值得更多的关注。