靶向LMP2特异性多肽的筛选、鉴定及应用基础

Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is highly associated with EB virus (EBV). EBV exists in the state of latent infection in NPC cells and expresses only a few of genes, in which latent membrane protein 2, LMP2 (LMP2A/LMP2B) expression presents in most of NPC tissues. Both LMP2A/LMP2B are transmembrane proteins in which their N-terminal and C-terminal domains are located intracellularly. LMP2A/2B have the same transmembrane domains, and the function of these domains is closely related to the location of LMP2A/2B, implying that LMP2A/2B is the ideal therapeutic targets for NPC. Our preliminary study found that LMP2A induced epithelial-mesenchymal transition in NPC cells, suggesting an important role of LMP2A in tumor formation and metastasis of NPC. Therefore, we set LMP2 as targets and screened many potential LMP2-bound peptides by phage display technology. We will continue testing the affinity of these peptides to LMP2 and identify the targeting peptides to LMP2 with high affinity. Once these peptides bind LMP2, the compounds of LMP2-peptide will get into cells by the metabolic pathway. Based on these, we will examine the effects of the LMP2-targeted peptides on NPC cells. Furthermore, we will couple these peptides with imaging or labeling agents or tumor therapeutic drugs, these peptides can bring these agents or drugs into LMP2-expressed NPC cells, to achieve the goals of the targeted therapy or molecular image of NPC.

EB病毒感染与鼻咽癌（NPC）的发生、发展密切相关，并以潜伏感染状态存在于NPC中，只表达少数基因。其中跨膜蛋白LMP2（2A和2B）表达于大部分NPC，其 N端和C端均位于胞内；LMP2A和2B具有相同的跨膜区，该结构域与其胞内定位密切相关，所以是NPC治疗的理想靶点。前期研究发现LMP2A可诱导NPC细胞发生上皮间质转化，在成瘤和转移中起重要作用；并以LMP2为靶标，采用噬菌体展示技术筛选出多个潜在的LMP2结合多肽。本项目拟进一步检测它们与LMP2的亲和力，鉴定出靶向LMP2并具高特异性和高亲和力的多肽。基于靶向多肽与LMP2结合后，可能随LMP2经代谢通路进入细胞内，为此我们将观察这些LMP2靶向多肽进入细胞后，对鼻咽癌细胞的生物学行为的影响。进而，将这些靶向多肽与肿瘤成像或治疗药物偶联，观察LMP2靶向多肽在鼻咽癌的诊断与治疗中的作用，为研发鼻咽癌的分子诊断和靶向治疗提供新思路。

鼻咽癌恶性程度较高，鼻咽癌的原发部位较为隐蔽，患者早期症状无特异性，在初诊的病例中，晚期鼻咽癌患者约占60%左右。因此，临床上迫切需要开发新的鼻咽癌的分子影像手段和新的靶向治疗方法，实现早期诊断，及时监测肿瘤复发转移、尤其是微小转移灶，提高肿瘤患者的早诊率和生存率。.我们噬菌体展示技术筛选出能与LMP2A特异性结合的靶向多肽（含7个氨基酸），鉴定出其靶向结合蛋白为整合素alpha6 (ITG6)，同时发现整合素6在肿瘤中高表达，是肿瘤干细胞标志物，以其为靶点可以实现肿瘤的分子诊断和靶向治疗；该短肽结合纳米颗粒可以进入体外培养的鼻咽癌细胞，并能穿透血管进入裸鼠成瘤的鼻咽癌肿瘤组织中,指出该肽是理想的分子诊断和靶向治疗肿瘤的新型载体；在鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤模型中，将该靶向多肽与分子成像试剂Cy5偶联后，实现高特异性的肿瘤活体分子近红外技术成像；该靶向多肽偶联的凋亡肽，可以进入鼻咽癌细胞并诱发细胞凋亡。用纳米颗粒结合该靶向多肽并包裹顺铂，可以明显抑制肿瘤的生长，表明35号肽可用于实现体内靶向治疗。.我们将短肽与放射性核素99mTc偶联，色谱分析出99mTc-HYNIC-先导肽的分子量为1460.57。99mTc-HYNIC-先导肽注射进入小鼠，分别于30分钟，60分钟，120分钟和240分钟将老鼠猝死，测量各个器官的放射剂量，血液、心脏、肺、肝、脾、肾、胃、肠的器官摄入量其中肾的摄入量最高。明确标记靶向肽在鼻咽癌的良好显像效果，同时在其他肿瘤如乳腺癌和肺癌中也证实了其较好的肿瘤显像效果。在乳腺癌患者的临床观察实验SPECT/CT检测中，99mTc-HYNIC-先导肽能很好地显示乳腺癌患者的肿瘤灶，提示该靶向肽具有良好的肿瘤分子影像的效果。.综上所述，基于原始创新的LMP2A特异性结合的靶向多肽，是理想的分子诊断和靶向治疗肿瘤的新型载体，可用于实现分子影像与靶向治疗。合成的 99mTc-HYNIC-先导肽在动物模型和乳腺癌患者临床观察实验中具有较好的肿瘤标记效果。