基于内生真菌“获得性”产生甘草酸合成能力新发现的甘草有效成分复杂基因功能挖掘研究

18-αglycyrrhizic acid is an important component of magnesium isoglycyrrhizinate injection, which is the preferred drug to severe hepatitis and liver damage treatment. Isoliquiritigenin has anti-tumor activity, and isoliquiritin, liquiritigenin, liquiritin have antiulcer activity. Using biological synthesis method to produce them is the best measure to protect G. uralensis resources. Biosynthesis pathway analysis is the basis of synthetic biology. Super gene families are the key of analyzing biosynthesis pathway. Super gene families have many members, but only a few of them relate to effective components. For example, there are more than 300 copies in G. uralensis UGT gene family, but only one copy can catalyze the connection of glycyrrhetinic acid and sugar forming glycyrrhizic acid. Currently, medicinal plant as the object, the method of systematic screening, cloning each one, functional characterization of super gene family is inefficient. Based on the new finding that endophytic fungi "acquired" producing the ability of glycyrrhizic acid synthesis, the applicant intends to make endophytic fungi with new functions as the object, locking the active components candidate genes of new endophytic fungi obtained through multiple comparisons in the transcriptome, protein and metabolic group of original and new endophytic fungi, then research functions of these candidate genes. This project has an object with endophytic fungi, studying the new thought of efficiently researching complicated gene function, in order to lay a foundation for analyzing the biosynthesis pathway of G. uralensis effective components, and provide a new way for the functional gene research of other medicinal plants.

18-α甘草酸是异甘草酸镁注射液重要组分，是治疗重症肝炎、肝损伤首选药物，异甘草素具有抗肿瘤活性，甘草素、甘草苷和异甘草苷具有抗溃疡活性。利用生物合成方法生产它们是保护甘草资源的最佳措施。生物合成的基础是生合成途径解析，解析生合成途径关键是超基因家族，家族成员众多，但只有少数和有效成分有关，如甘草UGT超基因家族有300多个拷贝，只发现一个拷贝催化甘草次酸和糖连接形成甘草酸。目前以药用植物为对象，系统筛选、逐个克隆、表征功能的方法效率较低。基于内生真菌能够“获得性”产生甘草酸合成能力新发现，申请者拟以具有新功能内生真菌为研究对象，通过多重比较原内生真菌和新内生真菌的转录组、蛋白组和代谢组，锁定新内生真菌获得的有效成分候选基因，在此基础上挖掘这些候选基因的功能。本课题以内生真菌为对象，研究高效挖掘复杂基因功能的新思路，可为解析甘草有效成分生合成途径奠定基础，为药用植物功能基因研究提供新方法。

本项目在“内生真菌能够获得性产生甘草有效成分合成能力”假说指导下，建立乌拉尔甘草内生真菌菌种库、制备内生真菌“类感受态”细胞并回染甘草，掌握了甘草内生真菌菌种和数量的分布规律及内生真菌“获得性”产生甘草有效成分的规律。将获得合成能力的新内生真菌与原内生真菌进行多重比较转录组、代谢组、蛋白组及生物信息学分析，锁定了新内生真菌SQE、CPR、CHS、CHI、ILR-UGT和LR-UGT基因，经验证可能具有催化功能，再将这些基因与甘草基因进行相互关联研究，成功获得5条具有催化活性的甘草复杂功能基因。因此，本课题在基于“内生真菌-植物”两个层面开发了一个快速表征药用植物复杂超基因家族的新思路、新方法，加速了甘草有效成分生物合成途径的解析，为药用植物功能基因的研究提供了新方法。.（1）内生真菌层面：采集不同产地的乌拉尔甘草，分离、纯化内生真菌，建立甘草内生真菌菌种库。以11种优势菌为研究对象，建立内生真菌“类感受态”细胞的制备方法、回染甘草方法，发现了2株肉座菌目（Hypocreales）的“类感受态”细胞回染后促进了甘草有效成分的积累，重新分离后发现其获得了合成异甘草苷的能力，将获得这种合成能力的新内生真菌与原内生真菌进行转录组、蛋白组、代谢组的比较及系统进化分析，锁定了新内生真菌SQE、CPR、CHS、CHI、ILR-UGT和LR-UGT基因，生物信息学分析验证这些基因均具有对应的保守功能域，可能具备催化功能。.（2）植物层面：将锁定的新内生真菌基因与甘草转录组基因进行系统进化分析，发现二者部分基因具有较近的亲缘关系，通过基因克隆和功能表征，获得了5个具有催化活性的甘草复杂功能基因，建立了快速挖掘复杂功能基因的新方法。