一种新型mRNA激活的近红外荧光探针的合成及对乳腺癌肿瘤的早期诊断

近红外荧光成像目前广泛应用于活体在位无损监测，特别适合肿瘤的早期诊断，而其检测灵敏度则取决于荧光探针的设计。通常使用的近红外荧光探针存在着特异性差、具有严重的背景荧光干扰等问题。本申请课题拟在前期研究的基础上，以HER2 mRNA高表达的乳腺肿瘤为模型（整合素受体阳性），构建一纳米尺度的含有近红外荧光染料-反义寡聚核苷酸-纳米金的荧光猝灭体复合物即分子信标，并进行靶向修饰。当把该分子信标引入荷瘤鼠体内，在RGD靶向配体的介导下会选择性进入乳腺癌肿瘤细胞。由于复合物中反义寡聚核苷酸探针可与乳腺癌肿瘤细胞内高表达的HER2 mRNA互补结合，使得复合物中荧光分子和纳米金分离，导致复合物重新发射近红外荧光。这样，该病变部位荧光强度将明显高于周围正常组织，利用近红外成像系统便可对其进行成像从而早期诊断。与通常成像方法相比，本研究设计的探针无荧光背景干扰，能极大地增加肿瘤组织与正常组织的对比度。

肿瘤的恶性程度与转移能力和肿瘤细胞功能蛋白有着密切的关系。肿瘤细胞的代谢比较旺盛，很多与肿瘤生长及转移相关的蛋白表达量会上升，所以针对这些肿瘤发生发展相关的功能蛋白进行研究可以帮助人们更好的了解肿瘤发生的过程及为就此靶标的靶向治疗提供理论依据。而普通的研究方法比如RT-PCR、Westen Blot、明胶酶谱分析法和酶联免疫吸附试验（ELISA）等都要将肿瘤细胞取出或者破损提出核酸或者蛋白进行检测，这样不仅操作困难，更要损坏样品，破坏细胞活性，无法实时、在位检测这些功能蛋白的真实状态。近红外荧光分子成像因为其无辐射，组织穿透能力强，成本低廉等优势在小动物活体成像中发挥了重要作用，而开发出智能的近红外荧光分子探针是小动物荧光分子成像的关键因素。荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）为我们开发分子信标提供了原理。金纳米粒子作为无机纳米材料因其安全无毒，吸收光子效果好成为了受体的优先选择。量子点具有有机荧光染料无可比拟的优点，由于其激发波带较宽而发射波带较窄所以能够实现单波长激光的多荧光分子的激发。本项目首先成功合成了多种基于金纳米的分子信标用来检测肿瘤细胞信号通路上的关键蛋白的表达。运用柠檬酸三钠还原法合成出粒径在15nm左右的金纳米粒子，运用生物信息学的方法筛选到与检测蛋白核酸分子特异性结合的核酸片段作为连接受体供体的桥梁。对于分子信标的合成进行了优化。对合成分子信标进行严密的表征，同时考察了其稳定性、荧光恢复能力及细胞毒作用。最后将金纳米分子信标用于各关键蛋白表达的检测及信号通路上下游蛋白相互作用对表达的影响。同时本项目成功合成了基于量子点的分子信标用于体内外功能蛋白的检测。成功合成可见光及近红外波段的量子点以用来进行体内外检测，运用生物信息学的方法筛选出能够被功能蛋白酶特异性降解的肽段作为连接受体与供体的桥梁。将成功合成的分子信标用于体外细胞水平及体内小鼠的功能蛋白进行实时在位检测。本项目成功运用纳米材料的合成，量子点标记以及近红外无损实时在位连续检测技术，合成了一系列的新型的分子信标用于体内外检测。通过对于合成的优化，提高了各分子信标的稳定性及检测限度。本项目的研究成果为肿瘤细胞相关变异表达蛋白的检测提供了一种快速，简便，无损，实时在位检测的方法，促进了肿瘤监测及靶向治疗的的发展。