RanGTPase核质运输系统通过调控AIF核转移介导细胞凋亡的分子机制

The pro-apoptotic function of apoptosis-inducing factor (AIF), a caspase-independent apoptotic mediator, relies on nuclear translocation of AIF. However, the regulatory mechanism of the translocation of AIF to the nucleus of the apoptotic cells is undefined. During apoptosis, RanGTPase regulates nuclear-cytoplasmic transport of multiple apoptosis-associated proteins. And caspase-3 inactivates the RanGTPase-mediated nuclear transport machinery. Previously, we found that during the nuclear apoptosis of model organism Tetrahymena thermophila without caspase activity, RanGTPase is involved in the translocation of AIF to the apoptotic nucleus. This project will find out the involvement of RanGTPase nuclear-cytoplasmic transport system in nuclear import of AIF and the molecular mechanism of nuclear import of AIF directly mediated by Importin during apoptosis of human cells. And we will study the cross-talk between nuclear import of AIF regulated by RanGTPase and caspase-3 signal pathway, and its pro-apoptotic function. Finally, the study will reveal the molecular regulation of nuclear translocation of AIF-induced apoptosis by RanGTPase nuclear-cytoplasmic transport system. The results would be useful to clarify the pathogenesis of diseases related to AIF pathway-mediated cell apoptosis, and are expected to provide novel therapeutic targets for drugs inducing apoptosis of tumor cells.

凋亡诱导因子AIF可介导非caspase依赖的细胞凋亡途径，其促凋亡功能的发挥依赖于AIF核定位，但其转运入核的调控机制尚不明确。RanGTPase在细胞凋亡过程中调控多种凋亡相关蛋白的核质转运，同时Caspase信号通路可引起RanGTPase介导的核质运输机制受阻。前期研究发现，在无Caspase活性的模式生物嗜热四膜虫核凋亡中，RanGTPase参与AIF向凋亡细胞核转移的过程。本项目拟进一步分析RanGTPase核质运输系统参与人细胞凋亡初期AIF核输入过程及Importin介导的AIF入核分子机制，并探讨RanGTPase介导的AIF核输入与Caspase-3信号通路交互作用在细胞凋亡中的功能，最终揭示RanGTPase核质运输系统通过调控AIF核转移从而介导细胞凋亡的分子机制。研究结果有助于阐明AIF凋亡途径相关疾病的发病机制，并有望为促进细胞凋亡抗肿瘤药物提供新的治疗靶点。

Ran与不同效应分子相互作用，参与多种细胞增殖调控。不同物种Ran蛋白同源物在有丝分裂、减数分裂及细胞凋亡过程中的功能存在差异，深入研究不同物种Ran蛋白，有助于进一步阐明新的生物学功能。嗜热四膜虫是一种单细胞真核生物，具有精细的细胞周期进程和复杂的核发育过程，是研究蛋白功能理想的模式体系。四膜虫无性生殖期大核无丝分裂及有性生殖期亲本大核凋亡（即程序性核死亡，PND）的调控机制尚不清楚。本项目对Ran蛋白在嗜热四膜虫大核无丝分裂和亲本大核凋亡中的调控功能进行研究，获得如下结果：. 一、Ran1调控四膜虫有性生殖中亲本大核程序性核死亡过程。首先，免疫荧光分析HA-Ran1 WT/T25N/Q70L在四膜虫有性生殖过程中的动态定位模，表明Ran1 GDP/GTP循环可能发生在PND的亲本大核的核质屏障两侧。敲减RAN1基因导致PND进程受阻且凋亡诱导因子（Apoptosis-inducing factor，AIF）无法聚集到亲本大核。另外，Ran1T25N和Ran1Q70L分别促进和抑制AIF向亲本大核输入。最后构建了将AIF靶向到亲本大核的人工系统，将AIF主动输入到i RAN1敲减细胞的亲本大核中，发现亲本大核PND进程得到一定程度的恢复，进一步证明AIF是亲本大核PND进程中重要的效应因子。这些结果表明，Ran1可能通过调节AIF向亲本大核的输入来调控亲本大核的程序性死亡过程。. 二、Ran1WT/T25N/Q70L过表达引起四膜虫大核无丝分裂及胞质分裂受阻及胞质微管组装异常。过表达Ran1及其突变体蛋白破坏了正常的Ran1分布形式，进而影响大核无丝分裂进程并导致繁殖速度下降。过表达Ran1T25N相比过表达Ran1WT和Q70L对无丝分裂、胞质分裂及胞质微管组装的抑制效应更加明显。本实验结果表明，四膜虫中Ran GTPase可能通过Ran1 GDP/GTP循环，调控胞质微管网络的精确重排，从而调控大核无丝分裂和胞质分裂进程。. 本研究首次对Ran1蛋白在原生动物细胞中的定位和功能进行了系统研究，表明Ran1调控嗜热四膜虫无性生殖期大核无丝分裂过及胞质分裂，并通过AIF信号通路在有性生殖期亲本大核凋亡过程发挥重要调控作用，说明Ran GDP/GTP循环是一种普遍存在于真核细胞的、保守的调控机制。