miR-199a信号网络调控胰腺纤维化的研究

Fibrosis is the major pathological feature of chronic pancreatitis (CP). There are few effective methods to control or reverse it. With the support of young scientist fund of NSFC (81100316; 2012-2014), we have identified miR-199a as a key miRNA for promotion of pancreatic fibrosis. Moreover, it has been found that inhibiting the expression of miR-199a could contribute to curing the fibrosis. Further studies discovered that SIRT1, HGF and mTOR are important targets of miR-199a via gene chip and dual-luciferase assay. However, our preliminary results in combination with the relevant literature indicate that SIRT1 and HGF inhibit pancreatic fibrosis while mTOR could promote it. This implies that miR-199a involve in the processes of both pro-fibrosis and anti-fibrosis. This project intends to make clear the involved biological processes and signal pathways through these targets, and exhibit the regulation network of miR-199a. Furthermore, intervention in expression of these genes will be implemented in the rat model; whose expression of miR-199a is down regulated. This multi-target strategy of combining miR-199a and its targets will be carried out to enhance the anti-fibrosis effects of the single miR-199a intervention. This project will provide a theoretical basis for the research and development of anti-fibrosis drugs.

慢性胰腺炎（CP）特征性病理变化为胰腺纤维化，目前缺少有效控制或逆转方法。申请人承担的青年基金项目（81100316，2012-2014）筛选并确定了miR-199a是促进胰腺纤维化的关键miRNA，并发现抑制miR-199a能改善CP大鼠的纤维化，进一步通过基因芯片和双荧光素酶标记发现SIRT1、HGF和mTOR是miR-199a重要靶基因。然而已有报道和我们的数据初步提示SIRT1和HGF抑制胰腺纤维化，而mTOR具有促进作用，这意味着miR-199a同时参与促进和抑制纤维化进程。本项目拟明确上述三个基因在介导miR-199a影响胰腺纤维化过程中的功能作用及信号机制，构建以miR-199a为中心的调控网络。并在CP大鼠上抑制miR-199a表达的同时激活SIRT1、HGF或抑制mTOR，采用多靶点干预模式增强单独抑制miR-199a的抗纤维化效果，为研发抗纤维化药物提供理论基础。

慢性胰腺炎（CP）是一种胰腺组织和功能发生不可逆损害的慢性炎症性疾病，临床主要表现为反复发作的上腹部疼痛和胰腺内、外分泌功能不全，胰腺纤维化是其特征性病理改变，临床治疗以手术切除和内镜引流为主，但缺少有效控制或逆转纤维化的方法。胰腺星形细胞（PSC）的激活是胰腺纤维化的核心事件，我们在前期研究中，通过表达谱芯片和双荧光素酶基因报告检测系统，筛选并鉴定了miR-199a 在胰腺纤维化进程中三个重要靶基因：Sirtuin蛋白（SIRT1）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、肝脏生长因子（HGF）。本课题研究进一步确认了miR-199a的三个靶基因在TGF-β所致的PSC活化和胰腺纤维化过程中的作用，首先成功构建了分别从正常大鼠（NP）与慢性胰腺炎大鼠（CP）分离获得的CP-PSC、NP-PSC两种永生化细胞系，PCR证实CP-PSC的SIRT1与HGF的表达水平明显低于NP-PSC，mTOR和miR-199a表达水平明显高于NP-PSC。TGF-β1处理PSC后mTOR和miR-199a表达水平明显升高，而SIRT1和HGF的表达明显降低，而采用TGF-β信号特异性抑制剂（LY2157299）处理PSC后出现相反的结果。我们成功构建了过表达或敲减SIRT1、mTOR及HGF的腺病毒载体，转染到PSC细胞后发现mTOR属于促纤维化基因，而SIRT1与HGF为抑纤维化基因，然后通过采用SIRT1激动剂白藜芦醇（RSV）、HGF抑制剂（PHA-665752）、mTOR 抑制剂（雷帕霉素）分别处理PSC细胞，发现SIRT1介入了Akt 介导的ROS 代谢、NF-κB 介导的炎症反应和Smad3 的调控； HGF 介入了COX2-PEG 的抗纤维化途径、MMP 介入的凋亡和Smad7 的调控；mTOR通过TGF-β/Smads影响胰腺纤维化。最后，我们在大鼠CP模型上验证RSV、HGF、雷帕霉素对胰腺纤维化的影响，RSV、HGF、雷帕霉素处理能明显降低CP大鼠的胰腺组织纤维化程度，提示RSV、HGF和雷帕霉素具有一定的抗纤维化能力，组合注射结果表明RSV+HGF的综合效果最优。因此，本研究初步构建了以miR-199a 为中心的胰腺纤维化调控网络，优化了抗胰腺纤维化方法，为研发抗纤维化药物提供理论基础。