工业用腈水合酶全新蛋白质翻译后调节体系self-subunit swapping的研究

在对工业用酰胺生产菌Rhodococcus rodocroses J1中腈水合酶合成机理的研究过程中，发现了一种全新的蛋白质翻译后调节体系：self-subunit swapping(亚基自身交换)。此外，在亚基自身交换的研究过程中，首次发现了一种具有半胱氨酸氧化功能的机能蛋白质(e蛋白)。亚基自身交换揭示了蛋白质分子的一种新的表现形式，此项研究还有许多方面期待解明。本项研究运用分子生物学、蛋白质工学及生物物理学等试验手法，通过对亚基自身交换的过程、生理学意义及普遍性等几个方面的研究，全面阐明自身亚基交换的机理，揭示蛋白质大分子之间的相互作用关系，为提高腈水合酶的利用价值提供理论指导。同时，运用定点变异、质谱分析等手法、确立机能蛋白e的活性中心，揭示钴离子的结合与半胱氨酸的氧化对应关系等，全面阐明腈水合酶活性中心半胱氨酸的氧化机理。本结果对整个蛋白质领域的研究将具有重要作用。

在对工业用酰胺生产菌Rhodococcus rodocroses J1中腈水合酶合成机理的研究过程中，发现了一种全新的蛋白质翻译后调节体系：self-subunit swapping (亚基自身交换)。亚基自身交换揭示了蛋白质分子的一种新的表现形式，解明这种机制具有重大的意义。在以前的工作基础上，为了延续和拓展亚基自身交换的内容，我们选择了与其基因编码顺序有差异的Pseudomonas putida NRRL-18668来源的腈水合酶作进一步深入研究。在对P14K（P. putida NRRL-18668来源的腈水合酶的调控蛋白）在大肠杆菌中进行表达时发现其极易降解，通过点突变实验说明P14K降解符合细菌N端原则；在纯化分离P14K时，发现这种腈水合酶调控蛋白是一种P14K与α亚基形成的三聚体复合物α(P14K)2，并且发现单独的α亚基不能摄取钴离子，而只有在P14K的辅助下α亚基才能够摄取钴离子。通过截断实验、点突变实验和分子模拟分析发现，P14K的C端结构域是一段高度柔性且带正电的特征结构域，并且这一特征就是单独α亚基不能摄取钴离子而只有在P14K的辅助下才能够摄取钴离子的原因；通过设计多种突变体并结合腈水合酶钴离子扫描和活性恢复实验，证实了P. putida NRRL-18668来源的腈水合酶也具有相似的蛋白翻译后调节体系-亚基自身交换机制，这说明了亚基自身交换不仅存在于R. rodocroses J1来源的腈水合酶中也存在于与其基因编码顺序有差异的P. putida的腈水合酶中，说明亚基自身交换具有普遍性意义；通过构建遗传进化树分析这两种基因编码顺序有差异但都遵循亚基自身交换的腈水合酶，发现R. rodocroses J1的腈水合酶较P. putida的腈水合酶在生理进化上应该更具有优势。此外基于对亚基自身交换的深刻认识和理解，成功制作了一种不依赖该机制的性能更优良的新型融合腈水合酶突变体，丰富了亚基自身交换理论体系的内容；通过点突变实验和分子模拟分析，初步揭示了腈水合酶催化己二腈区域选择性的分子机制。