从katG、inhA基因突变角度探讨肺痨康抗耐异烟肼结核杆菌的分子机制研究

全球结核病疫情急剧恶化，耐药结核病形势严峻。我课题组在四川省科技厅攻关课题等资助下研发中药肺痨康并证实具抗耐药结核作用，但机制研究不够深入。结核菌耐药性产生主要与菌株染色体某些基因突变有关，修复相关突变基因可治疗疾病，突变基因可修复性和回复突变理论为修复耐药结核杆菌突变基因提供理论依据，但是未见相关报道。我们首次提出"肺痨康抗耐异烟肼结核杆菌的主要机制是修复耐异烟肼结核菌突变基因"的假说。本研究采用PCR-测序法确认获得性耐异烟肼结核菌突变基因katG、inhA等，采用聚合酶链反应单链构象多态性分析(PCR-SSCP)法观察肺痨康对耐异烟肼结核小鼠菌株突变基因katG、inhA等影响，用Solid技术进行部分样本全基因组测序（避免假阴性结论），首次证实耐异烟肼结核杆菌突变基因可修复性或改变性，揭示中药（肺痨康）抗耐异烟肼结核杆菌分子机制，为今后开展抗耐药结核菌研究提供新思路和新研究靶点。

全球结核病耐药发生率呈逐年上升趋势，耐药结核病形势严峻。课题组在前期临床和实验研究中发现中药肺痨康具抗耐药结核作用，但机制研究不够深入。结核菌耐药性产生主要与菌株染色体某些基因突变有关，修复相关突变基因可治疗疾病，突变基因可修复性和回复突变理论为修复耐药结核杆菌突变基因提供理论依据，但是未见相关报道。我们首次提出“肺痨康抗耐异烟肼结核杆菌的主要机制是修复耐异烟肼结核菌突变基因”的假说并开展研究。本研究将基因katG、inhA等突变的耐异烟肼结核杆菌菌株尾静脉注入小鼠体内制造耐药结核小鼠模型，使用异烟肼、肺痨康等药物干预8周后，分离出小鼠肺部结核杆菌，用全基因测序技术观察肺痨康对耐异烟肼结核小鼠菌株突变基因katG、inhA等影响，对比发现肺痨康并未使耐异烟肼结核杆菌突变基因katG、inhA修复或改变。于是，研究从另一侧面对一些免疫因子进行观察，结果发现肺痨康可以抑制耐异烟肼结核模型小鼠TLR2、TLR4、miRNA-155、miRNA-29b的高表达，肺痨康对耐异烟肼的作用机制可能与阻断炎症信号传导通路的激活及相关炎症基因的表达，减弱由它们介导的炎性因子的释放，增强机体免疫力有关。研究发现在耐异烟肼肺结核小鼠肺组织中，caspase-3、caspase-7的免疫组化染色表达升高, 经过肺痨康干预后降低，说明肺痨康治疗耐异烟肼肺结核可能与caspase-3、caspase-7引起的细胞凋亡有关。研究首次从基因角度研究了中药（肺痨康）抗耐异烟肼结核杆菌分子机制，这些研究可以为其他研究者提供一定的参考与借鉴。