eIF3a及其多态调控DSB DNA修复途径的机制和临床研究

Double strand break (DSB) DNA repair pathway is one of the most important mechanisms of cell survival, however, its regulation mechanism remains unknown. Our previous study found that eIF3a may regulate DSB DNA repair pathway, and we identified that eIF3a regulate cellular IRES activity to alter mRNA translation. We also found that eIF3a polymorphisms changed its downstream pathway activity. Therefore, we hypothesize that eIF3a and its polymorphisms regulate IRES activity of some proteins which play key role in the DSB DNA repair pathway, as a result change their expression level and DSB DNA repair pathway activity. In the present study, we will first employ comet assay, confocal microscopy, sucrose density gradient centrifugation and PCR array to identify DSB DNA repair pathway proteins under eIF3a regulation. Secondly, bioinformatics and dual luciferase reporter will be used to identify IRES elements of these proteins, in vitro transcription, prokaryotic expression, protein purification and EMSA will be performed to explore how eIF3a regulate these IRESs. Thirdly, common non-synonymous polymorphisms of eIF3a in Chinese population will be searched in the database. Then, the wild-type and mutant stable cell line will be established to explore if these polymorphisms affect eIF3a regulating DSB DNA repair pathway. At last, we will verify our hypothesis in nasopharyngeal carcinoma patients. The present study will provide a new regulation mechanism of DSB DNA repair pathway.

DSB DNA修复途径是维持细胞存活的重要途径，但其调控机制尚不清楚。我们前期工作发现翻译起始因子eIF3a可能参与调控DSB DNA修复途径，并且发现它调控细胞IRES活性，此外我们也发现eIF3a多态可以影响其下游通路活性。因此，我们推测eIF3a及其多态通过调控DSB DNA修复途径某些关键蛋白IRES活性来影响这些蛋白表达，进一步影响该途径整体活性。本研究我们首先使用单细胞凝胶电泳、激光共聚焦、蔗糖密度梯度离心和PCR芯片等方法鉴定受eIF3a调控的DSB DNA修复途径蛋白。然后使用荧光素酶报告基因、体外转录、原核表达和EMSA确定eIF3a对该途径的调控机制。再通过数据库检索和构建不同基因型稳定表达细胞株考察eIF3a多态是否影响其对DSB DNA修复途径调控作用，最后用鼻咽癌放疗患者临床验证我们的假设。本课题将为DSB DNA修复途径的调控提供一种新的机制。

本研究旨在从基础和临床两个方面探讨eIF3a及其多态对DSB DNA修复途径的调控作用。本课题进展顺利，基本按照计划完成了预期的研究目标。主要取得了以下研究成果：（1）发现了DNA修复蛋白RPA2的5’-UTR含有一个细胞IRES元件，并且eIF3a与该元件进行结合后，对其翻译进行调控。研究结果以第一作者发表SCI论文一篇Carcinogenesis. 2013 Jun;34(6):1224-31. （2）在卵巢癌患者中证明了eIF3a可以通过调控DNA修复通路蛋白XPC来影响其化疗疗效，并且与患者的最后生存密切相关。研究结果以通讯作者发表SCI论文一篇：Oncotarget. 2015 Sep 22;6(28):25441-25451. (IF=6.36)（3）证明了eIF3a的基因多态性可以影响铂类药物化疗毒副反应。研究结果以通讯作者发表SCI论文一篇：Acta Pharmacol Sin. 2015 Mar;36(3):375-84. (IF=2.91) （4）证明了eIF3a可以通过调控DNA-PK和DNA Ligase IV等基因的翻译来调控DSB DNA修复通路，探讨了eIF3a基因多态与鼻咽癌放疗敏感性和毒副反应的关系。收集了188例接受放疗的鼻咽癌患者，针对eIF3a的常见多态进行了分型工作，并且探讨了二者之间的关系。该部分结果正在进行数据分析和文章撰写。在本课题的资助下，申请人以第一作者或者通讯作者发表SCI论文3篇，其中2篇>5.0，培养硕士研究生1名，博士研究生1名，参加国内会议交流2次，国际会议交流1次。申请人在该项目资助下获得中国药理学会施维雅青年药理学工作者奖，湖南省生理科学会2013年度优秀学术论文特等奖，湖南省自然科学基金杰出青年基金和“湖湘青年英才”支持计划创新英才等称号。