RUNX3基因调控β-catenin/TCF抑制胃癌转移的机制及消痰散结方对其作用研究

The inactivation of anti-cancer gene plays an important role in gastric cancer metastasis. The expression of anti-cancer gene RUNX3 was found inactive in more than 80% gastric cancer patients. The RUNX3 inactivation takes part in the invasion and metastasis of gastric cancer, but the specific mechanism still remains unclear. Wnt pathway is important in gastric cancer metastasis, and RUNX3 can unit β-catenin/TCF to regulate Wnt pathway. Our preliminary study found that the RUNX3 protein level was lower in gastric cancer than that in cancer sides, and was negatively related with clinical stages, β-catenin and targeted gene CD44. Xiaotan Sanjie decoction could inhibit gastric cancer metastasis and prolong survival time, which may be attributed to its role in regulating RUNX3 and CD44v6. Does Xiaotan Sanjie decoction inhibit gastric cancer metastasis through β-catenin/TCF regulated by RUNX3? The study will look into the mechanism of inhibition of gastric cancer through β-catenin/TCF pathway regulated by RUNX3 gene and the intervention effect of Xiaotan Sanjie Decoction, including clinical tissue sample, and animal and cell experiments with modern molecular biotechnology such as gene silence.

抑癌基因失活是胃癌转移的重要机制之一，超过80%的胃癌患者可见抑癌基因RUNX3失活或表达减少，RUNX3失活参与了胃癌的侵袭转移，但具体机制不明。Wnt通路在胃癌的侵袭转移过程中有重要作用，RUNX3可与β-catenin/TCF结合调节Wnt通路。我们前期研究发现胃癌组织中RUNX3阳性表达率较癌旁降低，且与临床分期、β-catenin及靶基因CD44等蛋白表达水平呈负相关。因此，我们提出：RUNX3通过调节β-catenin/TCF通路抑制胃癌转移。课题组基于胃癌痰证理论创制的消痰散结方能抑制胃癌转移、延长生存期，机制与调节RUNX3及CD44v6有关。那么消痰散结方抗胃癌转移的机制是否通过RUNX3调节β-catenin/TCF实现？本研究拟采用基因沉默等分子生物学技术，从临床组织样本、动物及细胞实验，阐明RUNX3调节β-catenin抑制胃癌转移的机制及消痰散结方对其作用机理。

目的: 通过临床、体外、体内实验研究RUNX3/β-catenin信号在胃癌转移中的作用机制及消痰散结方的作用。方法: 免疫组化法检测人胃癌组织及癌旁组织RUNX3表达水平。体外实验将人胃癌细胞株SGC7901、MGC803进行RUNX3基因沉默及扩增，通过细胞划痕及侵袭实验研究RUNX3基因对胃癌细胞侵袭转移的影响，通过WB、RT-PCR检测RUNX3沉默及扩增后的人胃癌细胞株β-catenin、CD44、MMP7蛋白及mRNA的表达水平。并将RUNX3沉默人胃癌细胞分为消方低、中、高组、5-Fu组及对照组，检测给药后48h各组细胞β-catenin、CD44、MMP7蛋白及mRNA的表达水平。体内实验：将裸鼠随机分为A、B、C、D4组，A组尾静脉分别注射SGC7901人胃癌细胞，B、C、D组注射SGC7901-cas9细胞。其中C、D组小鼠分别给药消痰散结方和卡培他滨，采用活体成像技术观察各组小鼠的肺转移情况。于D35取肺组织，观察肺组织的肿瘤转移情况。并检测转移灶中β-catenin等蛋白表达情况。结果：人胃癌组织RUNX3的蛋白表达阳性率低于癌旁组织。体外实验结果显示：RUNX3扩增的人胃癌细胞的侵袭及转移能力较阴性对照组和空载体组下降，而RUNX3沉默的人胃癌细胞较阴性对照和空载体组增强。SGC7901-cas9的β-catenin、CD44、MMP7 mRNA高于对照组，MGC803-OE组β-catenin、MMP7 mRNA表达低于对照组（P均<0.05）。消痰散结方能降低SGC7901-cas9的β-catenin、CD44、MMP7mRNA表达及β-catenin、CD44的蛋白表达。.体内实验结果显示：尾静脉注射SGC7901-cas9的小鼠较对照组肺转移更易发生肺转移。C、D组肺转移灶数量少于A、B两组（P<0.05）。B组肺转移灶中β-catenin 、MMP7蛋白表达水平高于A组，CD组β-catenin 、MMP7蛋白表达水平低于B组（P均<0.05）。CD44在各组之间表达未见明显差异（P>0.05）。.结论：RUNX3可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路进一步抑制下游转移相关基因MMP7、CD44抑制胃癌的侵袭转移。消痰散结方可能介导RUNX3调控β-catenin/MMP7/CD44抑制胃癌的侵袭转移。