基于TLRs的T细胞免疫应答在RSV疫苗增强性疾病中的调控作用及机制研究

The development of RSV vaccine enhanced respiratory disease (RVED) is induced by RSV inactivted vaccine and up to now its mechanism was lack of understanding. In the previous study, we have set up a RVED mice model with inactivated RSV and observed an aberrant immune response characterized by Th1/Th2 imbalance, weak T cell immunity and found it may be realted to the poor activation of TLRs. With these preliminary findings,in this proposed research project,focusing on TLR2,3 and 4, we will firstly analyze DC,CD4+T cell,CD8+T cell and their TLRs expression and signalling transduction in vito based on a RVED mice model.Secondly, we will observe how these three immune cells play roles respectively in RVED in vivo by adoptive transfer experiment. Thirdly, MyD88 and TRIF knocked out mice will be adopted to investigate the differential roles of TLRs activation in DC and CD4+T cells and CD8+T cells during T cell immune response of RVED. Lastly, we will utilize TLRs agonists to further study the effect of improving TLRs activation in these three immune cells on aberrent T cell immune response. Through this study we try to explore mechanism of RVED mediated by TLRs which might provide theoretical and expereimental evidence for development of clinically used RSV vaccine.

RSV疫苗增强性疾病（RVED）是RSV疫苗应用后产生的副作用，其发生机制目前尚不明了。我们前期研究发现：RVED小鼠模型中Th1/Th2严重失衡，T细胞免疫效应减弱，并与免疫细胞表面TLR2、3、4的低表达相关，提示TLRs可能介导RVED的T细胞免疫应答。基于此，本项目拟以RSV的受体TLR2、3、4为切入点，以小鼠RVED模型为研究对象，在体外对DC、CD4+T细胞、CD8+T细胞及其TLRs表达、TLRs下游信号通路进行分析，在体内通过细胞过继转输观察以上三种免疫细胞在RVED中的作用。进一步，以MyD88-/-和TRIF-/-小鼠验证不同免疫细胞TLRs信号通路的激活分别在RVED的T细胞免疫应答中的作用，利用TLRs激动剂观察改善不同免疫细胞的TLRs激活状态对T细胞免疫应答的影响，以此阐明RVED通过TLRs介导的疾病发病机制，为RSV临床疫苗的发展提供可行的理论和实验依据。

呼吸道合胞病毒（RSV）是世界范围内导致婴幼儿严重下呼吸道感染的最重要病原体。对于RSV疫苗的研究可以追溯到20世纪60年代，但由于该病毒的灭活疫苗可引起 RSV 疫苗增强性疾病（RVED），所以至今尚没有安全有效的疫苗用于RSV的预防控制。RVED的形成机制目前仍不清楚。在RSV的识别中有着重要的哨兵分子作用的Toll样受体（TLR）近年来被认为与RVED的形成有关。本研究旨在建立能够稳定地模拟RVED 表现的小鼠模型，并以此为基础初步探索TLR激活状态的改变对RVED异常免疫应答造成的影响。本研究设置福尔马林疫苗接种组（FV组）、活RSV接种组（VV组）和PBS对照组（BV组）三组，做TLR激动剂相关研究时加设Poly(U)组和CpG组。接种后第28天用RSV A2株同时对各组小鼠进行滴鼻感染，模拟疫苗接种后的自然感染。结果显示： 一、与BV组和VV组相比， FV组小鼠的肺部炎症明显重于VV组和BV组，支气管周和毛细血管周可见大量淋巴细胞浸润，且在炎症区可见明显的嗜酸性粒细胞。FV组小鼠肺部RSV RNA含量明显低于BV组和VV组。FV组小鼠CD4+T细胞数最高，且CD4+T细胞IL-4、IL-17分泌以及IL-4/IFN-γ比例均高于VV组和BV组。FV组小鼠CD8+T细胞TNF-α和IFN-γ分泌明显低于VV组。 二、 Poly(U)组和CpG组小鼠的肺炎程度轻于FV组。FV组、CpG组和Poly(U)组小鼠肺部RSV RNA含量均明显低于BV组和VV组。FV组的CD4+T细胞IL-4、IL-13和IL-17分泌均明显高于VV组和BV组，Poly(U)组和CpG组小鼠CD4+T细胞IL-4、IL-13分泌明显低于FV组，CpG组CD4+T细胞IL-17分泌也明显低于FV组。FV组CD8+T细胞TNF-α和IFN-γ分泌均低于VV组和BV组，而Poly(U)组IFN-γ和TNF-α分泌均明显高于FV组，Poly(U)组仅TNF-α分泌分泌高于FV组。显示RVED小鼠模型初步建立成功，RVED小鼠呈现出Th2优势型免疫应答，且有CD8+T细胞功能不足；将FIRSV疫苗辅以TLR7/8激动剂Poly(U)或TLR9激动剂CpG可以明显改善RVED小鼠的异常T细胞免疫应答，提示TLR7/8和（或）TLR9的激活不足可能是RVED小鼠异常免疫应答形成的关键原因之一。