LPA–LPA1/4–ERM–NHERF1信号通路通过调控细胞骨架降低噪声性听力损伤的机制研究

Lysophosphatidic acid (LPA), an important lipid signaling molecule, plays varieties of biological functions by regulating its receptors. Although we have previously found that LPA might rescue noise induced hearing loss (NIHL) by inducing actin polymerization of cochlear cytoskeleton, the molecular mechanism is still unclear. Additionally, we have found that LPA could induce ROCK2 over-expression, but the level of ROCK2 expression was reduced after noise exposure, and phosphorylation of ERM proteins was also decreased. NHERF1, which is the scaffold protein of ERM, was also reduced after noise exposure. According to the literature, LPA1 and LPA4 are expressed in the outer hair cells. Thus, we make a hypothesis that LPA-LPA1/4-ERM-NHERF1 pathway may rescue NIHL through cytoskeleton regulation. This project aims to clarify the expression and function of LPA receptors; and to investigate the mechanism of LPA involved in ROCK2-EMR-NHERF1 pathway by gene silencing and co-immunoprecipitation, etc. We will also evaluate the effect of this pathway on cochear cytoskeleton regulation through scanning electron microscope and F-/G-actin assay. This project will help to clarify the mechanism of LPA attenuated NIHL from a new cytoskeleton view, and to provide a new method for prevention and treatment of NIHL.

溶血磷脂酸（LPA）是一种重要的脂类分子，通过其受体发挥各种生物学效应。我们前期研究发现LPA通过促进耳蜗细胞骨架微丝聚合而降低小鼠噪声性听力损伤，但其分子机制尚未阐明。我们还发现LPA可以促进ROCK2表达；而噪声却抑制ROCK2表达从而减少ERM磷酸化，并发现ERM接头蛋白NHERF1表达亦下调。此外，文献提示LPA1/4受体在耳蜗毛细胞表达。因此我们提出LPA-LPA1/4-ERM-NHERF1信号通路通过调控细胞骨架降低噪声性聋的假设。本项目拟采用免疫组化、受体拮抗等方法明确LPA受体的表达及功能；通过基因干扰、免疫共沉淀等阐明LPA通过调控ROCK2-EMR-NHERF1通路发挥作用的机制；利用扫描电镜和F-/G-actin实验探索调控该通路分子对耳蜗细胞骨架的影响。以期从细胞骨架调控的新角度，阐明LPA降低噪声性耳聋的分子机制，为寻找预防和治疗噪声性耳聋的新方法奠定基础。

溶血磷脂酸（LPA）是一种重要的脂类分子，通过其受体发挥各种生物学效应。我们前期研究发现LPA通过促进耳蜗细胞骨架微丝聚合而降低小鼠听力损伤，在此基础上，提出LPA-LPA1/4-ERM-NHERF1信号通路通过调控细胞骨架发挥其作用的假设。本项目中，我们发现 LPA1/4、ERM、NHERF1信号通路分子参与噪声性听力损失，LPA1在噪声性耳聋小鼠耳蜗组织中表达上调；通过耳蜗显微注射LPA1 siRNA抑制LPA1表达后，观察到细胞骨架蛋白p-ERM和NHERF1表达上调；但ABR听力检测发现，LPA1 siRNA组与Control siRNA组小鼠噪声暴露后听力变化无显著性差异，说明抑制LPA1不足以改变LPA对小鼠听力的保护作用，推测一方面原因可能与小鼠个体差异大、噪声耐受程度不一有关，另一方面LPA也可能通过其他途径发挥其作用。为进一步验证和阐明LPA的作用与机制，我们通过Tunel染色、流式细胞技术、ROS检测明确了LPA对体外培养小鼠耳蜗毛细胞HEI-OC1的抗凋亡及抗ROS损伤作用；通过光和声刺激，观察了LPA对斑马鱼的运动行为轨迹的变化，提示LPA对斑马鱼听觉系统具有一定的保护作用。研究发现LPA可以促进ROCK2、p-ERM、NHERF1骨架蛋白的表达，使细胞凋亡相关分子Bax、Caspase3 下调、BCL-2上调，并使自噬相关蛋白LC3BII、LC3BII/LC3BI的表达下调，从而发挥其抗损伤作用。我们进一步通过F-actin染色和透射电镜观察到耳蜗细胞超微结构的变化，发现LPA可以促进细胞骨架的有序排列、减少线粒体萎缩。此外，通过小干扰RNA转染抑制实验和流式细胞技术，观察到抑制LPA1表达可以显著降低LPA对耳蜗细胞的抗损伤能力、使凋亡相关蛋白Bax和Caspase3表达上调，说明LPA-LPA1通过启动耳蜗细胞内凋亡相关通路发挥保护作用。我们进一步通过TMT定量蛋白质组学筛选LPA发挥作用的相关通路，检测到参与LPA调控的57个差异表达蛋白，并将它们富集到多条KEGG通路，目前尚需进一步筛选验证工作。总之，本项目通过多重手段、多种模型明确了LPA对耳蜗毛细胞听觉器官的保护作用，阐明了LPA调控细胞骨架蛋白、凋亡和自噬的相关分子机制，筛选到参与LPA调控的差异表达蛋白，为后续深入研究奠定了基础。LPA有望成为一种新的听觉耳蜗细胞保护药物。