海岛棉抗坏血酸过氧化物酶亚基编码基因GbAPX抗黄萎病功能研究

Verticillium wilt in cotton results in serious loss in yield and fiber quality. Both genetic improvement and research on the resistance mechanism of cotton to V. dahliae are always important scientific problems in breeding and genetics. A gene homologous to APX (ascorbate peroxidase) was isolated from full-length cDNA library of resistant Gossypium babardense cv. Pima90-53 roots challenged with V. dahliae, which take part in resistance of cotton to Verticillium wilt. And it is a potentially resistant factor. In order to study on the function of GbAPX involved in resistance of cotton to verticillium wilt, the research is as following: First, the cotton expression pattern of the GbAPX will be conducted by using real-time PCR when induced by V. dahliae pathogen and signal molecules respectively. Second, virus-induced gene silencing (VIGS) expression vector will be employed to transform cotton and silence endogenous GbAPX gene of G. barbadense, and to mine cotton signal pathways that the GbAPX participates in by detecting expression of some marker genes, such as CAT and GST in ROS pathway. Finally, the resistance of transgenic plants was analyzed under V. dahliae stress and investigated the effects of GbAPX to ethylene (ET), abscisic acid (ABA) and hydrogen peroxide (H2O2). These will be significant to understand the molecular mechanism of cotton Verticillium wilt resistance, as well as to providing important scientific reference to cotton breeding.

棉花黄萎病严重影响棉花产量和纤维品质。抗黄萎病遗传改良和抗病机制研究一直是棉花遗传育种领域的重大科学问题。项目组从黄萎病菌诱导的海岛棉全长cDNA文库中分离了ascorbate peroxidase（APX）基因，其参与棉花抗黄萎病过程，是一种潜在的抗病因子。为探究GbAPX基因抗黄萎病功能，本项目拟进行以下研究：①棉花在黄萎病菌胁迫和信号分子处理后基因的表达规律；②构建VIGS表达载体并转化棉花，鉴定抗病性，并挖掘棉花GbAPX基因参与的信号途径；③研究转基因棉花在黄萎病菌胁迫下基因表达和抗性反应，并分析GbAPX 基因超表达对抗病相关内源性激发因子乙烯（ET）、脱落酸（ABA）和过氧化氢（H2O2）表达量的影响，探明基因的抗病作用及机制，为抗黄萎病育种提供科学依据。

棉花作为一种重要的经济作物，具有巨大经济和社会效益。棉花极易受各种生物和非生物胁迫的影响，其中棉花黄萎病是影响棉花产量最严重的病害之一。因此，利用优异种质资源培育抗病品种势在必行。但现有种质资源中抗病材料较少，且完全通过传统育种方法无法满足目前育种工作及棉花生产的要求，发掘抗病基因并从分子生物学角度解析抗性机制，进而开展基因的遗传转化，对于棉花抗病分子育种改良具有重要意义。.本研究基于实验室构建的黄萎病菌胁迫下海岛棉cDNA文库，分别从Pima 90-53、农大601和中棉所8号中克隆获得753 bp的棉花APX基因，并利用生物信息学、实时荧光定量PCR、VIGS及农杆菌介导的茎尖转化方法等对APX基因进行研究。.从棉花AD基因组序列中，筛选到APX家族的14条基因序列（GhAPX01- GhAPX14），并将其分为3个亚组，其中第一亚组8个、第二亚组5个、第三亚组1个；APX家族结构域有445个氨基酸，保守性较高，其编码蛋白表现亲水性；14个基因在A、D染色体组的分布较均匀，定位在细胞质、细胞核及类囊体。APX在根、茎和叶中均有表达，为组成型表达基因；黄萎病菌诱导后，该基因在Pima 90-53、农大601和中棉所8号中的表达量发生明显变化，且在抗病品种中的表达量高于感病品种；激素（SA、MeJA和ET）诱导后，APX表达量也发生明显变化，推测APX基因参与棉花抗黄萎病反应过程中且受激素调控。VIGS后沉默植株表现感病，茎部的木质素含量明显减少，APX酶活性极显著降低，且SA 和JA信号途径中一些抗病相关基因表达下调。构建了真核表达载体并进行基因枪介导的亚细胞定位及农杆菌介导的基因遗传转化。亚细胞定位结果发现质壁分离后细胞壁无荧光，该基因位于细胞质中的某细胞器。以陆地棉品种冀棉14的茎尖为外植体进行基因转化，经PCR检测有4株为阳性植株。.APX基因受黄萎病菌和激素（SA、MeJA、ET）的诱导，推测该基因参与这些激素的信号调控网络及棉花黄萎病抗病反应中，VIGS技术进一步负向验证了APX基因参与棉花黄萎病抗病反应，转基因阳性植株的获得为APX基因的超表达功能研究提供了材料。该研究为棉花抗黄萎病机制提供理论依据，还对棉花抗黄萎病分子育种具有重要的理论与应用意义。