拟南芥RSU3调控花粉管顶端生长的分子机理

ROP1 (Rho-like GTPase from plant 1) signaling plays a critical role in regulation of pollen tubes tip growth. It is well known that ROP1 regulates Ca2+ concentration and actin dynamics to manipulate the vesicle targeting and exocytosis. To identify new components in ROP1 signaling network, we performed a sensitized mutant screen using a homozygous Arabidopsis line, which expresses GFP-ROP1 under the control of pollen-specific LAT52 promoter. In this project, we identified a putative ROP1 suppressor. Knocking out of RSU3 (ROP1 suppressor 3) significantly suppressed the depolarized growth of pollen tube induced by ROP1 overexpression. RSU3 encode a function unknown protein with DUF810 domain, which highly expressed in the mature pollens and pollen tubes. Expression of GFP tagged RSU3 revealed that RSU3 was localized to apical plasma membrane (PM) and granular organs in pollen tubes. Based on stable and transient transformation system, multidisciplinary approaches (integrating molecular genetics, cell biology and biochemistry) will be performed to investigate RSU3’s role in regulation of pollen tubes tip growth, and study the functional interaction between RSU3 and ROP1 signaling network. In addition, we will reveal the molecular mechanism of ROP1 activity regulating by RSU3. This research project will have fundamental significance for elucidating regulatory mechanism in tip growth of plant cell, and will provide the theory basis for improving crop fertility by molecular intervention.

ROP1信号网络在花粉管顶端生长中发挥重要的作用，参与调控钙离子、微丝和囊泡运输等多方面。本项目以一个中度过量表达ROP1的转基因株系为背景材料，利用激活标签法构建突变体库，并从中筛选到一个ROP1抑制子突变体。该突变体中RSU3（ROP1 suppressor 3）的缺失能够明显削弱ROP1过量表达所诱导的花粉管去极性生长表型。初步研究发现RSU3是一个含有DUF810结构域的功能未知基因，主要在花粉及花粉管中表达，亚细胞定位于花粉管顶端质膜和胞内高速运动的颗粒状细胞器上。在此基础之上，本项目拟通过细胞、生化和遗传等多种研究手段，以稳定和瞬时转化系统为平台，研究RSU3在花粉管顶端生长中的功能，探讨RSU3与ROP1信号网络的相互关系及其可能的作用机理，对深入了解和揭示植物细胞顶端生长调控机理具有重要意义，并为通过分子干预提高作物育性这一增产策略提供必要的理论依据。

ROP1是一类重要的花粉管极性发育调控因子，本项目通过激活标签法构建了一个以ROP1 OX的转基因株系为背景材料的突变体库，并从中筛选到一个ROP1抑制子突变体。通过鉴定发现花粉管的异常表型是由于突变体中所编码的一个基因的表达缺失造成的，我们将该基因命名为RSU3（ROP1 suppressor 3）。pRSU3::GUS转基因植株的GUS染色发现RSU3主要在花粉及花粉管中表达。基于基因枪瞬时表达体系，RSU3-GFP所定位的颗粒状细胞器可以部分和SYP51所标记的反式高尔基体网络共定位。另外过量表达RSU3可以引起花粉管的去极性生长，形成肿大的顶端。ROP1抑制子突变体与野生型拟南芥进行回交，在后代中筛选去除ROP1过表达背景的突变体（rsu3-1）。另外购得另一个RSU3功能缺失突变体（rsu3-2），同时构建RSU3过量表达转基因株系（RSU3 OX）。rsu3-1，rsu3-2及RSU3 OX花粉管表现出不同程度的生长缺陷，即花粉萌发率显著下降以及长度显著缩短。RSU3包含一段DUF810结构域，利用缺失或融合等手段构建RSU3不同片段的瞬时表达载体，通过基因枪技术在花粉管中进行瞬时表达，观察各自定位及功能的变化情况。结果显示RSU3结构的完整性与其功能及定位的正常发挥存在一定相关性。RSU3的功能缺失能够减弱ROP1 OX 的花粉管去极性生长表型，暗示RSU3 可能对ROP1有正调控作用。因此，在花粉管中共同过量表达ROP1和RSU3，研究发现RSU3 可以增强ROP1所导致的去极性表型，形成更为肿大的花粉管顶端，进一步佐证了RSU3是一类ROP1的正调控因子。本项目深入研究了RSU3相关的调控花粉管顶端生长的分子机理，实验成果不仅对于植物细胞生长和形态建成等方面具有科学理论意义，而且还对于改良作物育性，提高作物产量等方面具有潜在的应用价值。