利用TALENs基因定点突变技术研究二穗短柄草农杆菌转化相关基因BdHTAs功能

TALE Nucleases (TALENs) are recently discovered promising tools that can be used for targeted genome modifications. With remarkable targeting range, high target specificity,TALENs are easy to design and assemble to create DNA breaks at precise loci which can be reparied by NHEJ in any organism. Targeted mutagenesis induced by TALENs has been successfully estalished in several model organisms and TALENs hold much promise to understand gene function.Our previous investigation on BdHTAs, a histone gene family in Brachypodium distachyon, revealed that BdHTAs overexprsion could improve Agrobacterium transformation efficiency. In this study, we plan to create BdHTAs targeted mutagenesis mutants using TALENs, and investigate BdHTAs gene functions involved in Agrobacterium mediated transformation. So we will firstly develop methods including TALENs design, assembly, selection and optimization, and then create gene function lost mutants of 13 members of BdHTAs by TALENs and analyze gene function using different genetic and molecular methods. Finally, we will identify BdHTA1 and discover molecular mechanism of Agrobacterium mediated transformation in Brachypodium. Through the process of a creating BdHTA targeted mutagenesis mutants, we will develop routine targeted mutagenesis with TALENs in Brachypodium. TALENs technology is being deployed in DNA targeting for applications ranging from understand gene function in Brachypodium to improving traits in Triticeae crop plants.

TALE核酸酶（TALENs）有着设计简单、组装容易、特异性高、广适性强等优点，是基因定点改造中最具应用潜力的新工具。目前TALENs技术已在多个物种中成功应用，如用其定制基因功能缺失突变体，可加速基因功能研究。本实验室前期研究结果表明二穗短柄草BdHTAs基因过表达能提高农杆菌转化效率。为准确揭示BdHTAs基因功能，本申请拟首先建立TALENs的设计、组装、筛选和优化技术体系；再用TALENs技术创制BdHTAs13个成员基因功能缺失突变体，通过遗传学和分子生物学手段分析，明确BdHTAs基因功能；然后筛选出能显著提高农杆菌转化效率的成员BdHTA1，通过分子机制研究，揭示农杆菌转化机理。研究可望解析BdHTAs基因功能，为利用BdHTA1提高农杆菌转化效率提供理论依据；同时搭建二穗短柄草TALENs基因定点突变技术体系，为麦类作物基因功能解析和定向分子育种提供新的技术途径。

基因组组编辑是近年来生命科学研究的热点，是进行基因功能缺失突变体创制、加速基因功能解析及实现关键农艺性状改良、加速分子设计育种进程的有效工具。本研究首次将基因组编辑技术引入到二穗短柄草中同时达到了两个研究目标：一是建立二穗短柄草TALEN基因定点突变技术平台；二是创制农杆菌转化相关基因BdHTAs的功能缺失突变体并解析基因功能。. 通过项目的实施，首次完成：.1）建立起可靠的二穗短柄草人工核酸酶原生质体PCR/RE快速检测系统，可对TALEN活性进行准确的鉴定，加速TALEN的筛选和优化进程；.2）完成对TALEN设计、组装、原生质体快速检测、载体构建、遗传转化、突变体筛选整个流程的优化，建立二穗短柄草TALEN高效基因定点突变技术体系；.3）通过BeckmanFX自动化工作站的整合，搭建二穗短柄草高通量TALEN基因定点突变技术平台；.4）对BdHTAs全基因家族各成员进行TALEN 设计、组装和原生质体筛选，构建二穗短柄草的基因敲除植物表达载体23个；.5）遗传转化筛选获得11个成员的基因定点突变，成功创制BdHTAs全基因家族的功能缺失突变体；.6）对BdHTAs功能缺失突变体和过表达突变体进行农杆菌侵染、二次转化等功能分析，研究揭示BdHTAs对提高农杆菌遗传转化效率的作用不大， HTA可能在麦类植物的遗传转化中并不是决定因素；.7）优化Cas9蛋白的密码子及配套的sgRNA表达，在水稻、玉米、小麦等植物中测试，建立了具有广适性的植物CRISPR/Cas基因组编辑技术体系；.8）在原生质体中对sgRNA的表达和定点切割活性进行测试，成功地建立了二穗短柄草的CRISPR/Cas基因定点突变技术体系。. 因此，研究取得了三方面成绩：一方面成功建立二穗短柄草TALEN基因定点突变技术体系，并搭建高通量植物TALEN基因定点突变技术平台，为麦类作物基因功能的解析和定向分子育种提供新的技术途径。另一方面成功创制BdHTAs功能缺失突变体，并分析农杆菌侵染的表型、分子机制，实现对BdHTAs基因功能更好的解析，推动了对麦类作物遗传转化机制的认识。同时，首次将基因组编辑的最新革命性突破技术CRISPR/Cas系统引入到水稻、小麦、玉米、二穗短柄草等多种植物中，成功地建立起了革命性的植物基因组编辑新技术体系。在完成项目的同时，拓展了研究内容、加大研究深度。