肝脏炎性微环境通过ISG15/USP18影响巨噬细胞分化及肝细胞先天免疫导致丙肝病毒耐药的机制研究

Viral hepatitis is a liver inflammation disease caused by hepatitis viruses. Hepatitis C virus (HCV) infects 150 million people worldwide, with over 80% of patients develop into chronic infections. Many patients are not sensitive to interferon(IFN) therapy (interferon resistance), of which the molecular mechanisms are not clearly defined. Previously, using microarray gene expression profiling we identified 18 differentially-expressed hepatic genes that can be used to predict whether a given patient will respond to interferon therapy or not (with accuracy>96%). Based on our study, we proposed the activation of endogenous type-I IFN signaling leading to increased expression of ISG15/USP18 contributes to interferon resistance. Increased expression of these ISGs in hepatocytes not only stimulates HCV replication but also inhibits IFN anti-HCV activity, collectively result in viral resistance to IFN. Interestingly, we also demonstrated that increased expression of ISGs in the liver macrophages (Kupffer cells) accurately predict patients who are able to respond to IFN therapy, indicating that macrophages play an essential role in IFN resistance. Our previous studies were based on hepatocytes, and we focus on macrophages in this current proposal. We will systematically explore how inflammation microenvironment in the liver activates ISG15/USP18 pathway to affect macrophage polarization to M1 or M2 phenotypes and their function, and how the macrophage/hepatocyte interaction inhibits hepatic innate immune response to cause IFN resistance of HCV. Taken together, these studies will shed light on novel molecular mechanisms of IFN resistance through the complex interactions among inflammation, local immune cells and innate immunity in HCV infection.

病毒性肝炎是由肝炎病毒引起的肝脏炎性疾病。全球约有1.5亿人感染丙肝病毒（HCV）,其中80%以上的病人发展为慢性肝炎。很多病人对干扰素治疗不敏感（耐药），但机理尚不清楚。我们前期用基因芯片分析筛选出18个宿主差异表达基因用于疗效预测（预测准确率>96%），并发现内源性干扰素信号传导通路激活导致的ISG15/USP18高表达与HCV耐药关系密切。这些干扰素刺激基因（ISG）在肝细胞内高表达，一方面刺激HCV复制，另一方面抑制干扰素抗病毒活性，导致HCV耐药。同时，我们也发现 ISG在巨噬细胞内的表达预示干扰素治疗对患者有效，提示巨噬细胞在HCV耐药中起作重要的作用。我们前期所有研究均是基于肝细胞，本项目研究重点是巨噬细胞，探讨肝脏炎性微环境如何通过刺激ISG15/USP18 的表达影响巨噬细胞分化（M1或M2）及功能，以及巨噬细胞与肝细胞如何相互作用进而抑制肝细胞先天免疫，导致HCV耐药。

病毒性肝炎是由肝炎病毒引起的肝脏炎性疾病。丙肝病毒（HCV）导致全球1.5亿人感染,其中80%以上病人发展为慢性。很多病人对干扰素治疗不敏感（耐药），但机理不清楚。我们前期发现内源性干扰素信号传导通路激活导致的ISG15/USP18高表达与HCV耐药关系密切。这些干扰素刺激基因（ISG）在肝细胞内高表达，一方面刺激HCV复制，另一方面抑制干扰素抗病毒活性，导致HCV耐药。我们还发现 ISG在巨噬细胞内表达预示干扰素治疗对患者有效，提示巨噬细胞在HCV耐药中起作重要作用。本研究以巨噬细胞为主要研究对象，探讨肝脏炎性微环境如何通过刺激ISG15/USP18 表达影响巨噬细胞分化（M1或M2）及功能，以及巨噬细胞与肝细胞如何相互作用进而抑制肝细胞先天免疫，导致HCV耐药。研究结果显示：1）肝脏炎性微环境（LPS，TNFa）以不依赖于I型干扰素的方式激活ISG15/USP18信号通路，增加其表达；2）高表达ISG15或USP18都能够促进巨噬细胞向M1型极化，抑制M2型标志物的表达，降低巨噬细胞对中性红溶液的摄取、降低ROS的表达，并抑制巨噬细胞对荧光标记乳胶微粒的吞噬。3）体外细胞培养及小鼠巨噬细胞置换结果显示，M2型巨噬细胞显著增强肝细胞对干扰素刺激的敏感性。USP18-/-小鼠腹腔渗出巨噬细胞主要为M2表型，而野生型小鼠腹腔渗出巨噬细胞主要为M1表型。I型干扰素刺激后，与USP18-/-小鼠腹巨噬细胞共培养的肝细胞中干扰素刺激基因Mx1、ISG15及USP18表达明显高于对照组。动物活体实验显示，与对照组相比，进行了USP18-/-小鼠巨噬细胞（M2 型）置换的野生型小鼠血清中M2型细胞因子表达水平更高。在I型干扰素刺激下，实验组小鼠肝组织中干扰素刺激基因Mx1、ISG15及USP18表达明显更高。HE染色显示，LPS处理并不导致严重炎症反应，但血清酶学显示，LPS处理会对肝脏功能造成一定损伤，而巨噬细胞置换能够逆转LPS引起的小鼠ALT和AST的升高。本研究以肝脏炎性微环境为切入点，一方面明确了肝组织局部炎症可以通过ISG15/USP18信号通路影响肝脏内巨噬细胞的极化；另一方面阐明了不同表型巨噬细胞（M1/M2）对先天免疫系统中干扰素信号通路的调节特点，为深入解析HCV慢性感染及干扰素耐受的机制提供了全新的数据。