与茉莉酸合成相关抗根结线虫韧皮部运输miRNA鉴定及功能分析

根结线虫是设施番茄栽培危害较大的病害之一，茉莉酸与嫁接技术对根结线虫具有一定的防治作用。本项目拟以番茄CM野生型及茉莉酸合成缺失与过量表达突变体为试材，自体嫁接或相互嫁接后接种根结线虫，构建其小RNA文库，以Solexa高通量测序技术为依托，开展与茉莉酸合成相关的抗根结线虫的小分子RNA的分离、鉴定。通过Mireap 与miRBase鉴定韧皮部运输到接穗中的新miRNA，构建miRNA表达载体，转化番茄，对miRNA的功能进行初步研究。同时采用生物学预测miRNA靶基因，利用TargetFinder_1.6注释miRNA靶基因，qRT-PCR研究靶基因的表达水平。以期挖掘番茄抗根结线虫的miRNA，研究其调控机理，对进一步揭示茉莉酸抗根结线虫机理及丰富嫁接提高植物对逆境抗性提供科学的理论依据。

根结线虫病严重危害蔬菜产业的发展与“菜篮子”的安全 近年来随着设施蔬菜复种指数的增加，造成设施内连作障碍严重，根结线虫病大面积发生，重者减产50%以上，甚至绝收。茉莉酸可以降低番茄根结线虫病的发生 茉莉酸（Jasmonic acid，JA）是高等植物体内的内源生长调节物质，作为系统性信号在植物生长发育及抗性反应中起着重要调节作用。我们研究发现，提高内源及外源茉莉酸水平能提高番茄抗根结线虫的能力（张立宁等，2011；Fan et al，2015）。茉莉酸提高番茄根结线虫抗性机制初探本实验以番茄野生型（WT），过表达前系统素转基因番茄（35S:PS）和茉莉酸合成缺失突变体（spr2）为材料，构建根结线虫侵染后WT、35S:PS和spr2韧皮部小RNA文库，并进行显著性差异表达分析与GO功能注释,筛选并初步阐明miRNAs在调控番茄根结线虫抗性中所起的作用。得到WT、35S::PS和spr2间550个表达差异的miRNA。根据miRNA前体的标志性发夹结构，预测得到45个（WT）、42（35S::PS）和52个（spr2）有靶基因的新miRNA。研究了接种根结线虫前后及外源喷施茉莉酸后相关miRNAs 的表达模式，通过过表达植株的建立，进一步研究了Mir319及其靶基因在番茄抗根结线虫中的作用机制，发现在过表达miR319a的番茄株系对线虫的侵染不敏感，但在过表达靶基因LA的番茄株系中这些基因呈现相反的表达模式。与野生型（WT）相比，过表达miR319a的番茄株系内源茉莉酸（JA）含量很低且在线虫胁迫下其含量没有显著变化，而过表达其靶基因LA的番茄株系内源茉莉酸（JA）含量很高且在线虫胁迫下其含量显著升高，约是同时刻WT的3倍。RNA-Seq、qRT-PCR及酵母单杂实验的结果显示LA蛋白抑制了JAZ3（JA信号转导途径的负调控因子）的表达。微嫁接实验和miRNA高通量测序表明，miR319是潜在的由源到库运输的miRNA。实验同时发现sly-miR4376、sly-miR169e-3p、sly-miR319b 等22个受miR319过表达影响而具有砧/穗间交流可能性的miRNA，其中未知miRNA7个。