二氢睾酮对男性巨噬细胞LOX-1表达影响的机制研究

雄激素与男性动脉硬化的关系尚未明确。申请者研究发现：不同浓度的二氢睾酮（DHT）对雄性鼠巨噬细胞植物凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）表达的影响存在差异，只有生理浓度DHT通过雄激素受体（AR）抑制LOX-1 表达。本研究拟在证实DHT对人类男性巨噬细胞LOX-1表达是否存在类似差异的基础上，通过酵母双杂交、巨噬细胞cDNA文库展示技术筛选出男性巨噬细胞内与AR相互作用的蛋白质；通过免疫共沉淀技术确认不同浓度DHT作用下，与AR相互作用的蛋白质差异；进一步采用基因缺失分析、点突变等方法确定受DHT-AR调控的转录因子在LOX-1基因启动子区的结合位点；从而明确不同浓度DHT作用下，与AR相互作用蛋白质的差异对转录因子与LOX-1基因启动子区结合的影响，最终明确不同浓度DHT对男性巨噬细胞LOX-1表达影响存在差异的机制。本研究将为男性动脉硬化的防治提供新的理论依据和治疗靶点。

项目的背景 雄激素对男性动脉硬化的影响尚不明确，课题组既往的研究结果表明：对于雄性巨噬细胞，生理浓度的二氢睾酮(DHT)可以减少LOX-1的表达，但机制尚不清楚。主要研究内容 通过构建酵母双杂交男性单核细胞cDNA文库，从该文库中筛选与雄激素受体(AR)配体结合功能区(LBD)相互作用的蛋白，应用Pull-Down实验及免疫荧光方法进一步确认蛋白间的相互作用；通过基因缺失分析、点突变等方法，确定DHT-AR对LOX-1启动子区作用位点；通过对比生理浓度的雄激素与完全阻断内源性雄激素作用对雄性动脉硬化的影响。主要结果 成功构建酵母双杂交男性单核细胞cDNA文库，在此基础上，成功完成酵母双杂交实验，从构建的文库中共筛选出9个(TPM3等)与AR的配体结合功能区（LBD）相互作用的蛋白，并成功通过免疫荧光、Pull-Down实验确认这些蛋白与AR间存在相互作用；应用人主动脉内皮细胞进行基因缺失分析、点突变等机制研究，成功确认了DHT-AR调控的转录因子NF-κB/AP-1在LOX-1基因启动子区的结合位点为 TRE位点，并应用ChIP assay实验进一步确认了P65及P-c-Jun在TRE位点的聚集；在成功构建apoE和AR双基因敲除小鼠模型基础上，比较生理浓度的雄激素与完全阻断内源性雄激素作用对雄性动脉硬化的影响，发现高脂饮食下，apoE和AR双基因敲除鼠动脉硬化程度较apoE单基因敲除鼠明显加重，而且双基因敲除鼠的动脉硬化病变部位巨噬细胞浸润及LOX-1表达也明显增加。关键数据 从男性单核细胞cDNA文库中共筛选出9个与AR配体结合功能区（LBD）相互作用的蛋白；明确了在人主动脉内皮细胞中DHT-AR通过调控NF-kB/AP-1在LOX-1基因启动子区TRE的结合，从而调控LOX-1的表达；高脂饮食下，apoE和AR双基因敲除鼠动脉硬化程度较apoE单基因敲除鼠明显加重，而且双基因敲除鼠动脉硬化病变部位巨噬细胞的浸润及LOX-1表达明显增加。科学意义 课题组从男性单核细胞cDNA文库中共筛选出9个与AR-LBD相互作用的蛋白质，明确了DHT-AR调控LOX-1表达的位点，并发现生理浓度范围内雄激素及其受体系统发挥抗雄性动脉硬化的作用，这对阐明雄激素对男性动脉硬化作用提供了研究的线索和新的理论依据，将为男性动脉硬化的治疗提供新的靶点，因而具有非常重要的临床意义。