水稻VDACs互作蛋白的筛选及作用机理研究

VDAC是线粒体外膜的重要组成成分，是代谢物在胞质和线粒体膜间层进行交换的主要通道。本项目利用本实验室前期从水稻基因组中克隆的8个vdac基因的序列，原核表达PolyHIS-OSVDAC融合蛋白并捕获水稻中与其相互作用的候选蛋白；通过生物素标记诱饵的Far Western方法对候选蛋白进行相互作用的验证；对获得的互作蛋白进行质谱分析，获取其多肽序列，再通过生物信息学方法预测互作蛋白的碱基序列。采用分裂-泛素膜酵母双杂交系统，用不同OSVDAC作诱饵筛选水稻不同组织和不同发育时期幼穗的cDNA文库，获得并验证与OSVDACs相互作用的阳性克隆。比较2种捕获方法获得的互作蛋白的特征，进行相互印证；对阳性的互作蛋白进行与OSVDACs互作位点的作图，研究其与OSVDACs相互作用的机制。本研究对于阐明水稻vdac多基因家族存在的必要性及其生物学功能的机制，指导其实际应用有重要意义。

VDACs主要定位于线粒体外膜上的孔状蛋白，能同其它线粒体外膜上的蛋白形成复合体，在胞质和线粒体之间进行代谢物质的转运。本实验室前期鉴定并克隆了8个水稻VDAC基因。本项目利用细胞质雄性不育保持系YTB幼穗构建了一个应用于膜蛋白的酵母双杂交全长cDNA文库，由2.4×106个独立克隆组成，插入片段平均大小为1.0 kb（0.4-2.2），从300个平板中随机挑选的136个转化子中132个有插入片段，91%与已知功能的基因存在序列同源性，冗余量低于4.6%。利用保留了N端75个氨基酸残基的pBT3- SUC- OsVDAC5 75从水稻YTB幼穗cDNA膜酵母双杂交文库中筛选和鉴定出7个蛋白与OsVDAC5互作（OsVDAC5 Interaction Protein，OsV5IP1-7）。以pBT3-N-osvdac3 ORF作为诱饵蛋白筛选该文库，鉴定出3个阳性蛋白（OsV3IP1-3）。生物信息学预测结果显示它们都是膜相关蛋白，分别定位于线粒体、内质网、叶绿体内囊体膜、质膜、微体、。全长CDS酵母点对点杂交证明OsVDAC5与7个OsV5IP都有相互作用，而OsVDAC3与OsV3IP1及OsV3IP2具有互作。Pull-down实验表明OsVDAC5与OsV5IP1的N端239aa之间有相互作用。OsVDAC5与OsV5IP2的C端120aa之间可能没有相互作用。BiFC结果表明OsVDAC5 与OsV5IP1和OsV5IP2都有相互作用，并且互作发生在膜上。对T1代OsVDAC3超表达转基因植株进行盐胁迫和甘露醇胁迫，结果显示OsVDAC3是水稻逆境胁迫中的正调控因子。水稻CMS不育系YTA中超表达Osvdac3，花粉育性和套袋自交结实率明显增加，保持系YTB中干涉Osvdac3后，出现部分不育花粉，这表明Osvdac3可能参与水稻HL-CMS及育性恢复的发育相关通路。根据以上结果可以推测，OsV3IP3接受信号后传递给OsVDAC3，OsVDAC3与OsV3IP1发生互作，将信号传递给OsV3IP1，通过OsV3IP1调控下游基因的表达，OsVDAC5可能与能量代谢相关，通过影响、调控能量代谢来调节水稻的生长与发育。这些发现将为研究不育（恢复）基因通过影响能量代谢从而导致雄性不育（可育）的机理提供新思路。