应用花菁类近红外荧光探针实现海洋环境中硫酸盐还原菌的荧光成像及快速检测

Sulfate-reducing bacteria (SRB) are a large of microorganisms that use sulfate as terminal electron acceptor for energy generation, they are the most corrosive and widely studied corrosion microorganisms. Since common used SRB detection methods are time-consuming and complicated operating, our program is to take their characteristic sulfide (H2S、HS-、S2-) metabolic process as a breakthrough point, take advantage of fluorescence imaging technique, design cyanine based near-infrared fluorescent probes for the characterized metabolite in SRB cells, and finally realize in vivo fluorescence imaging and rapid detection of SRB. The main contents are shown as follows: design and synthesize cyanine based near-infrared fluorescent probes, illuminate the inherent effect of modification group on the specific recognition abilities, fluorescent properties, and membrane permeability of the fluorescent probes, analyze their targeting properties and signal sensing mechanisms against sulfide targets, reveal their cell membrane permeation processes and in vivo accumulation properties, and then realize functional designation and regulation of fluorescent probes; on the basis of these findings, optimize detection conditions and parameters, explore the metabolic characteristics and distribution regularity of SRB produced sulfide, develop fluorescence imaging and rapid detection methods for SRB, evaluate detection performances of selectivity, stability, etc., and finally explore the practicability of the proposed SRB imaging and detection systems.

硫酸盐还原菌（SRB）是一类以硫酸根离子为电子受体异化有机物并从中获取能量的微生物的统称，是腐蚀性最强，也是研究最广泛的腐蚀微生物。本项目针对常用SRB检测技术检测周期长、操作复杂等缺点，以其特有的硫化物（H2S、HS-、S2-）代谢过程为切入点，借助荧光成像检测技术，设计多种能够特异性识别SRB细胞内特征代谢产物的花菁类近红外荧光探针，实现对目标微生物的原位活体成像及快速检测。主要研究内容包括：设计并合成花菁类荧光探针，阐述改性基团的性质对荧光探针识别特异性、荧光特性以及细胞膜穿透性能的内在影响，分析推断不同荧光探针对硫化物目标分子的靶向性及信号传感机理，深入探索荧光探针的透膜能力及胞内蓄积性质，实现荧光探针的功能化设计与调控；在此基础上，优化测试条件与参数，探索SRB细胞内硫化物的代谢特点与分布规律，建立SRB的荧光活体成像与快速检测方法，评价检测选择性、稳定性等性能，探索实用化可能。

作为微生物腐蚀中最典型的，也是最重要的腐蚀微生物，硫酸盐还原菌（Sulfate-reducing bacteria, SRB）广泛分布于土壤、海水、河水、淤泥、地下管道、油气井、港湾及锈层中，由SRB引起的腐蚀占所有微生物腐蚀的1/2。快速检测SRB种群浓度对研究微生物腐蚀机理及监测微生物腐蚀过程均具有重要意义。目前，最常用的SRB测定国标方法是MPN法。该检测方法拥有极高的检测灵敏度和极低的检测限，但其耗时较长，操作繁琐，是一种既耗时又耗力的检测手段。由于不能再短期内获得检测结果，会影响施工的进展和杀菌措施的调整。本项目针对常用SRB检测技术检测周期长、操作复杂等缺点，以其特有的硫化物（H2S、HS-、S2-）代谢过程为切入点，借助荧光成像检测技术，设计并合成了多种能够特异性识别SRB细胞内特征代谢产物的基于IR780荧光团的花菁类有机小分子硫化物荧光探针、细胞内CdS纳米颗粒荧光探针、聚多巴胺纳米点荧光探针、3D纳米阵列的荧光探针、自组装DNA纳米荧光探针、多价单糖修Cu:CdS量子点探针、巯基苯硼酸-Ag荧光探针、细胞裂解物识别荧光探针的研究，对每种探针的识别机制进行了研究，测试并优化了环境因素对荧光探针信号的影响。研究采用荧光技术对上述探针检测SRB的检测性能进行了评价，包括检测范围、稳定性和特异性性能，采用荧光成像技术实现了SRB的原位成像，归纳并分析了不同近红外荧光探针的检测性能。本研究工作既具有高度的科学性，同时又与实际应用联系紧密，具有较强的应用普遍性和实用性。首先，研究通过研究纳米粒子或生物蛋白质材料的生物标记技术，建立基于纳米粒子或生物材料标记技术的SRB检测方法，具有较强的科学意义，相关研究结果已参与出版学术专著1部，在SCI期刊发表高水平论文9篇，影响因子总和达43.18。此外，新型腐蚀微生物检测方法能够在保证检测特异性与稳定性的基础上将检测时间缩短至2天以内，有望部分甚至完全取代现有的SRB检测技术，能大量的节省人力物力，蕴藏着提高社会和经济效益的巨大潜力。