人类PIF1解螺旋酶的功能研究

PIF1解螺旋酶家族在生物体内具有很多重要的生理作用。前期研究中我们在国际上首次纯化了人类PIF1全长蛋白，还首次发现了PIF1蛋白的N-末端具有一定的保守性，将其命名为PINT功能域，并证明了PINT功能域具有使单链DNA复性形成双链的性质。本课题拟采用RNA干扰技术，分别"沉默"PIF1全长基因、PIF1的PINT功能域及PIF1解螺旋酶功能域，对比基因"沉默"细胞和野生型细胞在对损伤的耐受、端粒长度等方面的差异，以明确PIF1解螺旋酶在DNA修复、端粒调节等方面的生理功能。同时结合酵母双杂交实验，寻找与PIF1蛋白相互作用的靶蛋白或上下游信号分子，进一步明确PIF1在体内的生理功能。对于候补基因进行克隆、纯化，与纯化的重组人类PIF1蛋白，建立试管内蛋白复合体反应体系，从而从分子水平理解人PIF1解螺旋酶的作用机制。而这将可能为包括肿瘤在内的多种人类疾病提供新的治疗靶点。

PIF1解螺旋酶家族具有很多重要的生理作用，我们推测人PIF1具有DNA损伤修复功能。本课题首先对PIF1的生物化学活性进行了深入分析，接着用不同剂量的紫外线和γ射线照射细胞，检测PIF1诱导表达情况。酵母双杂交筛选了与PIF1 PINT结构域相互作用蛋白。建立了PIF1基因敲低的细胞，比较PIF1敲低细胞辐射敏感性的差异，同时过表达PIF1全长、解螺旋酶模序及PINT结构域，欲进一步验证PIF1抗DNA损伤功能。主要结果：.（1） PIF1mRNA组织特异性表达谱分析：用购自Clontech的人类多组织cDNA文库，PCR分析显示PIF1mRNA在检测的16个组织都有表达，胸腺、脾及睾丸表达量相对较高。.（2） 检测了影响PIF1蛋白ATP酶活性的因素：结果显示PIF1对温度很敏感，对PH值较不敏感，低盐对PIF1活性有促进作用而高盐则抑制其活性，与Mn2+、Zn2+、Ca2+相比，Mg2+最能刺激PIF1活性，RPA和SSB均抑制PIF1活性。.（3） 检测了不同长度脱氧寡核苷酸链对PIF1的ATP酶活性的刺激能力：显示从60个碱基到30碱基，碱基每减少10个，ATP酶活性下降15%。.（4） 检测了PIF1蛋白对不同长度脱氧寡核苷酸单链的结合能力：从60个碱基到30个碱基，结合能力逐渐降低。.（5） 发现PIF1除具有ATP酶活性外，还具有GTP酶、UTP酶、CTP酶活性；.（6） PIF1除具有ATP酶支持的解链活性外，还具有GTP、UTP、CTP支持的解链活性。.（7） 酵母双杂交技术筛选与PIF1解螺旋酶模序端和PINT结构域端分别相互作用蛋白： PINT结构域端共筛选3个阳性作用蛋白。.（8） 2Gy、4Gy、10Gyγ射线照射HepG2细胞， PIF1 mRNA均呈现先降低后升高的趋势。.（9） 不同剂量紫外线照射HeLa细胞，结果显示5J/m2、15J/m2紫外线照射Hela细胞后，PIF1蛋白呈先降低后升高趋势。.（10）构建了PIF1敲低的Hela细胞，比较PIF1敲低细胞和对照细胞的γ射线诱发的DNA损伤修复能力的影响，结果表明PIF1敲低后HeLa细胞DNA损伤修复能力降低。.(11) 建立PIF1全长、解螺旋酶模序和PINT结构域过表达的HT1080细胞，欲比较不同细胞γ射线诱发的DNA损伤修复能力的差异。