罗汉松中抗烟草花叶病毒活性成分的分离纯化与作用机制研究

It is difficult to develop safe and effective antiviral drugs because viruses use the hosts cells energy, materials and place to replicate, and until now the significant breakthrough in this research field is still blank. Natural products from plants have been proved to be a rich resource because plants have already evolved multiple mechanisms to selectively suppress pathogens by production of secondary metabolites with antimicrobial activities. The great pool of natural products provided a lot of opportunity for researchers to develop virus inhibitors with high efficiency and low toxicity from plants. Preciously we found that acetone extract of Podocarpus macrophyllus showed dramatic antiviral activity to tobacco mosaic virus (TMV), it was proved that some components of the extract have the obvious function of inhibiting virus infection and replication. In this project, we will clarify the structures of the objective components responsible for the anti-TMV activity according to bioassay-guided isolation of the related extract by methods of modern purification and structure-identificated techniques and semi-synthesis of dilactones from abundant natural Podocarpic acid. In addition to the structures study of the antiviral components we will also test the inhibiting activity of the compounds to several animal virus have the same infected mechanism with TMV. To seek for effective antiviral lead compounds with low toxicity we will further study the antiviral mechanisms of those antiviral compounds from P. macrophyllus by methods of biochemistry and molecular biology. Those works will provide a base for further exploration of new type of plant virus inhibitors. In addition, our work will promote the utilization and development of the plant P. macrophyllus.

病毒复制所需的物质、能量和场所完全依赖寄主，病毒对寄主的绝对寄生性，使得开发高选择性的抗病毒药物存在极大困难，至今仍未取得重大突破。植物中存在丰富的次生代谢产物，一般而言，植物中存在的化学防御物质对植物本身的自毒性应该是较小的，所以从植物中开发高效、低毒、环境友好的抗病毒剂是目前的研究热点。前期的研究中发现罗汉松的丙酮提取物中存在具有显著钝化烟草花叶病毒，抑制病毒侵染和增殖的活性成分。本项目旨在前期研究的基础上，通过活性跟踪，运用现代化的分离纯化技术和结构鉴定手段以及从常见中间体出发的多样性导向合成，分离和制备罗汉松中的活性单体，探讨其抗病毒活性的构效关系，研究其对与植物病毒有相同感染机制动物病毒的抑制活性，从中寻找高效、低毒的天然抗病毒先导化合物，并结合生物化学和分子生物学手段进一步研究其抗病毒机理，为新型植物病毒抑制剂的研制提供科学依据。同时也为今后罗汉松的综合开发和利用提供科学依据。

本课题共分6部分进行，基本达成了预设任务。1、对罗汉松枝叶中的总二萜进行系统的提取、分离和纯化，总二萜得率为1.13%，采用运用现代化的分离纯化技术和结构鉴定手段从中分离鉴定了12个萜类单体，包括5个二萜双内酯和7个二萜。2、建立减压回流法、超声辅助法和闪式提取法对竹柏和罗汉松枝叶中的总黄酮进行系统的提取、分离和纯化，总黄酮得率在8.147—15.522%，采用运用现代化的分离纯化技术和结构鉴定手段从中分离鉴定了18个黄酮单体，包括6个双黄酮、3个黄酮碳苷和9个单黄酮。3、采用微胶囊双水相法对罗汉松枝叶中的总挥发油进行系统的提取、分离和纯化，挥发油得率为1.369%，并采用气相色谱-质谱联用技术从挥发油中分离鉴定出22 种单体化合物，其中，萜烯及其含氧衍生物18 种，脂肪族化合物4 种，主要物质为石竹烯、-蒎烯和-蒎烯。4、对竹柏总黄酮、罗汉松总二萜、总黄酮和总挥发油进行了抗氧化活性研究，实现结果显示几种提取物均表现出较好的抗氧化活性，其中总黄酮的抗氧化活性最佳。5、对竹柏总黄酮、罗汉松总二萜和总黄酮及部分单体化合物进行了抗烟草花叶病毒活性研究，实验结果显示总二萜提取物显示出了抑制TMV侵染的活性，在浓度为50mg/mL时，抑制率大于80%。但是TAS-ELISA 检测和Western blotting 检测均没有抑制TMV增殖的作用，提示提取物有可能是在病毒进入寄主体内之前，能够有效地阻止病毒进入寄主细胞。6、对竹柏总黄酮、罗汉松总二萜和总黄酮及部分单体化合物进行了抑制酪氨酸酶活性研究，实验结果显示总二萜提取物和部分二萜单体显示出显著的抑制酪氨酸酶活性，其中桃拓酚的抑制率可以达到83.87%，属于可逆的混合型抑制剂，米氏常数Km为0.33 mg/mL，抑制常数KI为0.44 mg/mL，KIS为0.85mg/mL。相关研究成果发表研究论文7篇，其中1篇获得“领跑者5000—中国精品科技期刊顶尖学术论文”，发表会议论文3篇，申请并授权实用新型专利1项，培养研究生3名。